海水中16種脂溶性貝類毒素的液質聯用檢測方法技術

一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質聯用檢測方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定。本發明專利技術檢測方法采用樹脂主動吸附海水中的貝類毒素，且可對海水不同分層進行特異性吸附，后經過萃取步驟分析海水中16種脂溶性貝類毒素的檢測。且與傳統方法相比，采樣量少，降低成本，操作簡單方便，穩定性強。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種脂溶性貝類毒素的檢測方法，特別是一種。
技術介紹
海洋生物毒素(貝類毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物產生、能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的、對其他生物包括人類產生危害的一大類小分子有毒化學物質。針對這些生物毒素，研究者初期主要根據所引起的中毒癥狀將其分為六大類麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、腹灣性貝類毒素(DiarrheticShellfish Poisoning, DSP)、神經性貝類毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)、記憶缺失性貝類毒素(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)、西加魚毒素(Ciguatera FishPoisoning, CFP)、藍綠藻毒素。不過隨著研究的深入，新的生物毒素種類不斷被發現，且多種毒素如OA往往與毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒機理，原有分類方法已不能滿足管理和科研的需求。因此，2004年，由聯合國糧農組織、世界衛生組織和政府間海洋委員會共同組建的雙殼類軟體生物毒素工作組將貝類毒素分為八大類，分別為石房蛤毒素組(Saxitoxin, STX)、軟骨藻酸組(Domoic acid, DA)、大田軟海綿酸毒素組(Okadaicacid, 0A)、原多甲酸毒素組(Azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素組(Brevetoxin, BTX)、蛤毒素組(Pecenotoxins, PTX)、奸夷扇貝毒素組(Yessotoxin, YTX)和環亞胺類毒素(Cyclicimines’CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins,P1TX)和西加魚毒素(Ciguatoxins,CTX)也正在被考慮是否劃作貝類毒素中。現有8大類貝類毒素中，STX和DA毒素組較易溶解于水，比較而言0A、AZA> BTX、PTX、YTX、CIs均為聚醚類物質，具熱穩定性，易溶解于甲醇、乙醚等非極性有機試劑中，因此被統一稱作為脂溶性貝類毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。貝類毒素的嚴重危害性已引起多個國家的密切關注，以歐美加等為首的發達國家相繼制定了貝類毒素監控國家計劃。傳統的監控方法主要是定期對相關海域中的雙殼貝類進行貝類毒素的含量及產毒藻種類和數量進行監測，以評估貝類毒素的風險性，對保護消費者安全，確保貝類產業健康發展做出了積極貢獻。然而，傳統手段需要采集大量的貝類和藻類樣品才能對貝類毒素做出有效預警，不僅耗費大量的人力物力，而且時效性不強。2004年，MacKenzie等人首次報道了一種固相吸附毒素追蹤技術(Solid phase adsorption toxin tracking, SPATT),主要是利用特異性吸附材料對目標毒素進行吸附，然后實驗室內洗脫、濃縮和凈化后經LC-MS檢測。SPATT技術與傳統方法相比，不僅大量減少采樣分析工作量，而且還可以監控目標海域不同水層貝類毒素的變化，同時結合貝類中毒素和有毒藻的變化情況，對貝類毒素有早期預警作用，具有很大的發展前景。現有的檢測技術主要還是小鼠生物法，存在動物福利以及檢出限高且不能明確辨析貝毒成分等問題，雖然質譜檢測技術也已開始用于貝類毒素的檢測，但檢測種類比較單一，或前處理方法尚需進一步完善。因此建立一種快速、靈敏、準確的多種脂溶性貝類毒素同時檢測方法變得尤為重要。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種針對性強、操作簡單、檢測速度快、檢測面廣、降低了測試成本、易于推廣應用的。本專利技術是通過以下 的技術方案來實現的。一種，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定，具體步驟如下(I)吸附袋的制作用聚酯網布，縫制成布袋，裝入樹脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龍掛扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸餾水浸泡去除甲醇，隨即放入密封的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存，待用；(2)吸附袋的使用把吸附袋系在長繩上，分上、中、下三層，層間隔至少超過5米以上，否則相應減少層數，每層一次固定3個及以上吸附袋，將繩系于固定位置的漂浮桿上，每間隔7-10天將吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸餾水沖洗，放入預先編號的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存；(3)毒素萃取將樹脂填料轉入沙芯濾柱中，用50_70mL去離子水洗去鹽分，把柱中水份正壓吹干，加入20mL甲醇，濾入蒸發瓶中，再加入20mL甲醇重復提取一次，提取液在40°C使甲醇揮發，殘余l_2mL水，用5mL 二氯甲烷萃取后離心，取出二氯甲烷層，再用5mL 二氯甲烷重復萃取一次，合并兩次二氯甲烷萃取層后用氮吹干，用l.OmL 80%的甲醇定容，以O. 22 μ m的濾膜過濾，進樣高效液相色譜-串聯質譜分析；(4)測定條件與方式待測樣品用液相色譜-串聯四極桿質譜進行測定，儀器參數條件見表1，選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量見表2 ；表I液相色譜-串聯四極桿質譜的儀器參數條件本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質聯用檢測方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定，其特征在于具體步驟如下：(1)吸附袋的制作：用聚酯網布，縫制成布袋，裝入樹脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龍掛扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸餾水浸泡去除甲醇，隨即放入密封的塑料袋中，在4℃條件下短時間保存，待用；(2)吸附袋的使用：把吸附袋系在長繩上，分上、中、下三層，層間隔至少超過5米以上，否則相應減少層數，每層一次固定3個及以上吸附袋，將繩系于固定位置的漂浮桿上，每間隔7？10天將吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸餾水沖洗，放入預先編號的塑料袋中，在4℃條件下短時間保存；(3)毒素萃取：將樹脂填料轉入沙芯濾柱中，用50？70mL去離子水洗去鹽分，把柱中水份正壓吹干，加入20mL甲醇，濾入蒸發瓶中，再加入20mL甲醇重復提取一次，提取液在40℃使甲醇揮發，殘余1？2mL水，用5mL二氯甲烷萃取后離心，取出二氯甲烷層，再5mL二氯甲烷重復萃取一次，合并兩次二氯甲烷萃取層后用氮吹干，用1.0mL？80％的甲醇定容，以0.22μm的濾膜過濾，進樣高效液相色譜？串聯質譜分析；(4)測定條件與方式：待測樣品用液相色譜？串聯四極桿質譜進行測定，儀器參數條件見表1，選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量見表2；表1液相色譜？串聯四極桿質譜的儀器參數條件表2選擇反應監測母離子、子離子、碰撞能量和掃描方式(5)定性測定在同樣測試條件下，試樣溶液中脂溶性貝類毒素的保留時間與標準物質保留時間相對偏差在±5％以內，且檢測到的定性離子的相對豐度，應與濃度相當的標準溶液中定性離子的相對豐度一致，基峰與次強碎片離子豐度比應符合表3要求；表3基峰與次強碎片離子豐度比要求？？次強碎片離子相對豐度％？？＞50？？＞20～50？？＞10～20？？≤10？？允許相對偏差％？？±20？？±25？？±30？？±50(6)定量測定將混合標準工作液和試樣溶液等體積進樣測定，按外標法使用標準工作曲線對樣品進行定量，試樣溶液和標準溶液中脂溶性貝類毒素的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。...

【技術特征摘要】
1.一種海水中16種脂溶性貝類毒素的液質聯用檢測方法，包括吸附袋的制作、吸附袋的使用、毒素萃取、測定條件與方式、定性測定和定量測定，其特征在于具體步驟如下 (1)吸附袋的制作用聚酯網布，縫制成布袋，裝入樹脂之后密封，在正方形布袋的一角固定尼龍掛扣，把吸附袋在甲醇中浸泡，然后用蒸餾水浸泡去除甲醇，隨即放入密封的塑料袋中，在4°C條件下短時間保存，待用； (2)吸附袋的使用把吸附袋系在長繩上，分上、中、下三層，層間隔至少超過5米以上，否則相應減少層數，每層一次固定3個及以上吸附袋，將繩系于固定位置的漂浮桿上，每間隔7-10天將吸附袋取出，再放入新的吸附袋，提取的吸附袋用蒸餾水沖洗，放入預先編號的塑料袋中，在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚志軍，吳海燕，郭萌萌，李兆新，王聯珠，翟毓秀，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院黃海水產研究所，
類型：發明
國別省市：