一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法技術

本發明專利技術公開了一種一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，采用Langendorff灌注裝置經主動脈逆行灌流，依次用含鈣液、無鈣EGTA液、Ⅱ型膠原酶液灌流，收集Ⅱ型膠原酶循環液加入10%BSA溶液，將心室置于其中恒溫搖床震蕩消化，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，過濾，濾液自然沉降，收集細胞沉淀，懸浮在酶洗脫液中重復沉降即得心肌細胞，該方法獲得的大鼠心肌細胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心臟的活細胞產量最高可達約（5-8）×108個，本發明專利技術采用單一消化酶分離心肌細胞并用逐步梯度復鈣法沉降，既簡化了實驗步驟，又大大提高了心肌細胞的存活率，簡單經濟，是分離成年大鼠心肌細胞行之有效的方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及細胞的分離和提取
，特別是涉及一種采用。
技術介紹
隨著心臟疾病研究的不斷發展，心臟離體實驗已越來越被人們所重視，尤其是具備正常生理功能的單個心肌細胞已成為研究心臟代謝、功能、病理生理機制的重要基礎。目前心肌細胞的提取與培養多采取乳鼠或幼鼠為主，但乳鼠心肌細胞與成熟心肌細胞在功能及結構上都存在不同程度的差異。成年大鼠心肌細胞的分離與培養方法也有多種，灌注酶解法用于成年大鼠的心肌分離已有40余年的歷史,但至今仍無統一的方法可循。自Powell等于1976年首先成功分 離出單個鈣耐受成熟心室肌細胞以來，迄今為止國內也僅有少數單位初步建立了可用于原代培養的心肌細胞分離方法。究其原因，是因為心肌細胞分離的每一步都會對最終分離的細胞狀態產生重要的影響。實驗室溫度、Langendorff裝置設定溫度、心臟摘取速度、水質、溶液的PH值、酶的種類、活力及濃度、細胞內外鈣濃度變化、操作者的熟練程度等都會影響心肌細胞狀態。目前可見的成年大鼠心肌細胞分離與培養方法的報道中，均是采用兩種酶混合消化，或者反復的復鈣及沉降，這樣增加了操作難度和步驟，容易污染，細胞成活率不高。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是克服現有分離提取方法不穩定、成活率低、操作步驟復雜的缺陷，提供一種。為了解決上述技術問題，本專利技術采用如下的技術方案 本專利技術包括如下步驟 (1)裝置預處理設置Langendorff灌注裝置恒溫于37°C，消毒，超純水灌流，預充灌注母液； (2)灌流將成年大鼠離體心臟掛于LangendorfT灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6-10ml/min，用含鈣液灌流l_2min，然后用無鈣EGTA液灌流4_5min，再用II型膠原酶液單向灌流I. 5-2. 5min，之后循環灌流IO-ISmin ;灌流含鈣液有助于使離體心臟恢復跳動從而排除心腔及心臟冠狀動脈系統內的殘留血液；灌流無鈣EGTA液使心肌細胞處于低鈣狀態，心臟完全停跳，消減心肌細胞間Ca2+依賴的緊密連接，有助于細胞外基質的解離疏散；灌流II型膠原酶液用于消化心臟； (3)消化剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集II型膠原酶循環液，加入10%BSA溶液至BSA終濃度為8-12mg/ml，取5-10ml，將心室置于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5-8min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入O. lmol/L的CaCl2溶液45-55 μ 1，共4次；將心室肌組織用含有1%BSA的II型膠原酶液在恒溫振蕩器中振蕩消化可使心室解離，從而得到游離的桿狀細胞； (4)沉降用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15-20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15-20min，如此重復洗滌2_3次，所得自然沉降物即為心肌細胞； (5)前述步驟中所用的試劑為 灌注母液NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L,D-Glucose 10 mMol/UMgCl2 · 6H20 3. 5 mMol/UNaH2PO4 0. 4 mMol/L，用 O2 和 CO2 體積比為 95:5 的混合氣飽和15min, NaOH 調節 pH 至 7. 20 7. 35 ； 10%BSA制備100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4°C條件下攪拌混勻，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4°C透析lh，換新鮮含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4°C下靜置過夜，然后分裝，儲存在-20°C備用；· 含鈣液在灌注母液中加入CaCl2,使Ca2+終濃度為500-750 mMol/L ； 無鈣EGTA液在灌注母液加入EGTA，使EGTA終濃度為100 mMol/L ； II型膠原酶液取灌注母液加入II型膠原酶和CaCl2,使II型膠原酶和Ca2+濃度分別為0. 02-0. 06% (質量)和 60-90 mMol/L ； 酶洗脫液灌注母液中加入10%BSA和CaCl2,使BSA和Ca2+終濃度分別為lmg/mL和80-100 mMol/L。優選的，上述方法中灌流步驟為將成年大鼠離體心臟掛于Langendorff灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6ml/min，用含鈣液灌流l_2min，然后用無鈣EGTA液灌流4-5min,再用II型膠原酶液單向灌流2min,之后循環灌流10_18min。消化步驟為剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集II型膠原酶循環液，加入10% BSA溶液至BSA終濃度為10mg/ml，取5-10ml，將心室置于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入0. lmol/L的CaCl2溶液50 μ 1，共4次。沉降步驟為用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15_20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15-20min，如此重復洗滌2_3次，所得自然沉降物即為心肌細胞； 前述方法中，在裝置預處理步驟，所述消毒室用75%乙醇灌流10分鐘消毒。優選的，在消化時，先將心室由心尖至心底剪開，再放入含有BSA的II型膠原酶循環液中。上述技術方案中，在消化酶的選擇上，本專利技術只采用單一消化酶分離心肌細胞，消化酶的濃度和消化終止時間很重要，II型膠原酶使用濃度為0. 02-0. 06%時即可在8-15分鐘內對大鼠心臟充分消化。消化酶的濃度過高及消化時間過長都可造成細胞膜不可修復的損害。有報道認為當心臟顏色變黃，表現較松弛時終止酶消化較合適。但申請人卻發現II型膠原酶灌流持續8-18min時，心臟腫漲，晶瑩剔透(但并非表面發白，如出現發白則心肌已消化過度)，心室變得松軟即可停止灌流，且滴下的灌流液顯微鏡下可見單個心肌細胞，此時終止消化較合適。心肌細胞體積較大，經過酶液灌流消化后細胞膜損傷已較嚴重，故本專利技術不對心室肌進行剪碎處理，而是通過加有1%BSA的II型膠原酶液在恒溫振蕩器中反復振蕩使心室肌自然解離，收集細胞懸液獲取心肌細胞。最大程度減少對心肌細胞的物理傷害。另外，國內文獻報道梯度復鈣多用四步法，且多使用單獨配制的復鈣液，本專利技術采用逐步增加鈣濃度，逐步梯度復鈣。這樣既簡化了實驗步驟，又有效的減少了心肌細胞內鈣離子濃度迅速提高引起心肌細胞內鈣失衡的概率，從而大大提高心肌細胞的存活率。同時經過酶洗脫液的反復潤洗和自然沉降，有利于心肌細胞的純化。與現有技術相比，本專利技術采用Langendoff灌流裝置經主動脈逆行灌流分離成年大鼠心肌細胞是一種較好的方法，該方法獲得的大鼠心肌細胞中75-93%都具有活性，每只 大鼠心臟的活細胞產量最高可達約(5-8) X IO8個，本專利技術采用單一消化酶分離心肌細胞并用逐步梯度復鈣法沉降，既簡化了實驗步驟，又大大提高了心肌細胞的存活率，簡單經濟，是分離成年大鼠心肌細胞行之有效的方法。具體實施例方式I、實驗動物清潔級成年SD大鼠(由第三軍醫大學實驗動物中心提供)，雌雄不拘，體重200 350g。2、主要本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于包括如下步驟：（1）裝置預處理：設置Langendorff灌注裝置恒溫于37℃，消毒，超純水灌流，預充灌注母液；（2）灌流：將成年大鼠離體心臟掛于Langendorff灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6？10ml/min，用含鈣液灌流1？2min，然后用無鈣EGTA液灌流4？5min，再用Ⅱ型膠原酶液單向灌流1.5？2.5min，之后循環灌流10？18min；（3）消化：剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集Ⅱ型膠原酶循環液，加入10%？BSA溶液至BSA終濃度為8？12mg/ml，取5？10ml，將心室置于其中，37℃、130？160次/min恒溫搖床震蕩消化5？8min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注Ⅱ型膠原酶液開始，每4分鐘加入0.1mol/L的CaCl2溶液45？55μl，共4次；（4）沉降：用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15？20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15？20min，如此重復洗滌2？3次，所得自然沉降物即為心肌細胞；（5）前述步驟中所用的試劑為：灌注母液：NaCl？130？mMol/L、KCl？5.4？mMol/L、HEPES？5？mMol/L、D？Glucose？10？mMol/L、MgCl2·6H2O？3.5？mMol/L、NaH2PO4？0.4？mMol/L，用O2和CO2體積比為95:5的混合氣飽和15min，NaOH調節pH至7.20～7.35；10%BSA制備：100mg/mlBSA溶解在含80？mMol/L？Ca2+的灌注母液中，在4℃條件下攪拌混勻，放入含80？mMol/L？Ca2+的灌注母液中4℃透析1h，換新鮮含80？mMol/L？Ca2+的灌注母液，在4℃下靜置過夜，然后分裝，儲存在？20℃備用；含鈣液：在灌注母液中加入CaCl2，使Ca2+終濃度為500？750？mMol/L；無鈣EGTA液：在灌注母液加入EGTA，使EGTA終濃度為100？mMol/L；Ⅱ型膠原酶液：取灌注母液加入Ⅱ型膠原酶和CaCl2，使Ⅱ型膠原酶和Ca2+濃度分別為0.02？0.06%（質量）和60？90？mMol/L；酶洗脫液：灌注母液中加入10%BSA和CaCl2，使BSA和Ca2+終濃度分別為1mg/mL和80？100？mMol/L。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁貴友，王峰，湯全，肖志超，蔡慶勇，
申請(專利權)人：遵義醫學院附屬醫院，
類型：發明
國別省市：