本發(fā)明專利技術屬于寄生蟲學領域，提供了一種衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～129所示、或者與SEQIDNO：1～129中的任何一條序列互補的序列。本發(fā)明專利技術還提供了上述的衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲microRNA在制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲的疫苗中的應用。本發(fā)明專利技術還提供了一種抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲生長發(fā)育的組合物。本發(fā)明專利技術還提供了一種基因芯片。本發(fā)明專利技術首次從衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲分離獲得一類新的miRNA，這些miRNA能影響衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲的生理功能，同衛(wèi)氏并殖吸蟲的發(fā)育，分化相關，本發(fā)明專利技術可制備用于抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲的基因工程疫苗，為防治衛(wèi)氏并殖吸蟲提供了新的途徑。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及寄生蟲學領域，尤其涉及一種衛(wèi)氏并殖吸蟲，具體涉及衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲特異表達的micoRNA及其應用。
技術介紹
衛(wèi)氏并殖吸蟲{Paragonimiasis westermani)也稱肺吸蟲,成蟲主要寄生于人、貓、狗等肺臟里，蟲卵隨排泄物排出體外，進入水中發(fā)育并孵出毛蝴。毛蝴侵入第一中間宿主川卷螺，經過胞蝴、母雷蝴、子雷蝴與尾蝴各期，尾蝴從螺體逸出后，侵入第二中間宿主石蟹或蜊蛄。體內發(fā)育為囊蝴，人因生食含有石蟹或蜊蛄而感染。童蟲在人體需經移行才能到達肺臟。衛(wèi)氏并殖吸蟲病一般癥狀表現(xiàn)為外周血嗜酸性粒細胞增多，咳嗽、咳鐵銹色痰，如果蟲體寄生在其他部位也會產生相應癥狀。目前，該病的診斷主要是痰液涂片檢查蟲卵 和免疫學檢查血清抗體。MicroRNAs CmiRNAs)是一類大小長約2(Γ25個核苷酸，內源性的具有調控功能的非編碼RM,在許多真核生物中都曾經被發(fā)現(xiàn)。這類RNA的功能主要是參與機體或細胞的調節(jié)途徑，包括發(fā)育、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等過程。在寄生蟲研究領域，已有研究表明寄生線蟲存在獨特的miRNA轉錄后調控機制，它們可以通過miRNA實現(xiàn)對宿主和自身基因表達模式的精確調控，從而提高感染和自身增殖的幾率并逃避免疫監(jiān)視。通過選擇性地抑制或阻斷某一特定發(fā)育期線蟲的發(fā)育，從而減少和阻斷寄生線蟲的傳播途徑。衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲特異表達的miRNA有可能成為其免疫預防和化學防治的新分子靶標，為核酸疫苗的制備奠定基礎。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于提供一種衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲micoRNA及其應用，所述的這種衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲micoRNA及其應用要解決現(xiàn)有技術中的抗蠕蟲藥物造成的寄生蟲抗藥性問題，以及動物產品和環(huán)境中的藥物殘留問題，同時提供了一種新的抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲生長發(fā)育的方法。本專利技術一種衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲microRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 129所示、或者與SEQ ID NO :1 129中的任何一條序列互補的序列。其中，所述互補的序列為DNA或RNA。進一步的，所述互補序列為經過修飾的DNA或RNA，具體的，如硫代修飾或甲氧基修飾。本專利技術還提供了任一所述的衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲microRNA在制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲的疫苗中的應用。本專利技術還提供了一種抑制衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲生長發(fā)育的組合物，含有有效量的至少一個寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對應于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補的序列。 本專利技術還提供了一種基因芯片，包括一個固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應于如SEQ ID NO: I 129中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: I 129中的任何一條序列互補的序列。本專利技術所提供的衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲特異表達的micoRNA均分別克隆衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲，成熟的miRNA序列長度為18 25 nt。對其miRNA進行深度測序，獲得衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲的miRNA表達譜，通過比對發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO :1 129所示的miRNA只在衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲中表達，而在參照基因組日本血吸蟲中不表達。因此，在衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲內過量表達SEQ ID NO :1 129或采用miRNA反向互補序列抑制SEQ ID NO :1 129的表達將影響衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲生理功能及器官分化相關的功能。因此，本專利技術衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲特異表達的miRNA可用于制備抗衛(wèi)氏并殖吸蟲的疫苗。與現(xiàn)有技術相比，本專利技術具有如下有益效果 本專利技術衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲特異表達的miRNA可以選擇性的抑制或阻斷肌肉期這一特定發(fā)育期蟲體的發(fā)育，從而減少或阻斷寄生蟲，尤其是衛(wèi)氏并殖吸蟲的傳播。本專利技術miRNA制備成為衛(wèi)氏并殖吸蟲疫苗時，作為核酸疫苗，避免了傳統(tǒng)抗蠕蟲藥物造成的全球性分布的寄生蟲抗藥性問題，也不會導致動物產品或環(huán)境種內藥物的殘留。具體實施例方式實施例I 一、miRNA的獲得 1.總RNA抽提 1)將樣本(衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲一條)放入研體中，加入少量液氮,迅速研磨,待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg組織/ml Trizol加入Trizol,轉移入離心管； 2)加入250μ L氯仿，劇烈振蕩10s，使液體充分混勻呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5min ； 3)在4°C 條件下，以 12000r/min 離心 15min ； 4)將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，然后在4°C條件下靜置10- 15min ； 5)在4°C條件下，以12000r/min離心15min,小心并盡可能去掉上清； 6)用ImL75%乙醇洗滌RNA沉淀和管壁，在4°C條件下，以12000r/min離心8min，然后小心棄去乙醇； 7)將RNA沉淀進行干燥(不能完全干燥)處理后，用10μ L RNase - free水將RNA溶解，直接用于反轉錄。 2.總RN A純度和完整性檢測 I )純度檢測取I UL R N A樣品50倍稀釋,在BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀上測定OD值，OD 260/0D 280的比值大于I. 8。2)總RNA完整性取RNA樣品I μ L，1%瓊脂糖凝膠電泳80 VX 20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA 5S rRNA, 18S rRNA和28S rRNA條帶，三條帶條帶完整。 3.small RNA序列的獲得和篩選 用15% PAGE膠回收20-30 nt的small RNA，加上5’和3’端接頭(購自Illumina公司)后實施RT-PCR (反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司)。產物經6 %TBE PAGE膠純化后進行Solexa測序。然后屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測序質量差的序列(例如測序信號很低等)及長度小于18 nt的序列獲得clean reads。 4.miRNA的鑒定用 BLAST 程序(NCBI, www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)將 clean reads 與 GenBank 和Rfam database (version 9. O) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)進行比對分析，去除非編碼RNA序列,包括rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA,和other ncRNA ;通過Repeatmasker (http: //www. repeatmasker. org)去除轉座子等重復序列；然后搜索 SangermiRBase (version 13. O)數(shù)據庫,尋找序列相似性miRNA。將衛(wèi)氏并殖吸蟲所表達的miRNA與已報道的日本血吸蟲進行比較，分別屏蔽掉兩兩共有相關的序列，獲得衛(wèi)氏并殖吸蟲未注釋的miRNA。此外，為了提高反向互補序列的作用和細胞內穩(wěn)定性，上述衛(wèi)氏并殖吸蟲特異性 miRNA的反向互補序列可以是DNA或RNA，還可以對反向互補序列進行硫代、甲氧基等修飾。實施例2 本專利技術還提供了任一所述的衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲miCToR本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲microRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1～129所示、或者與SEQ？ID？NO：1～129中的任何一條序列互補的序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：陳家旭，周曉農，艾琳，陳木新，朱興全，陳韶紅，張永年，李浩，郭儉，田利光，蔡玉春，盧艷，儲言紅，陳海寧，張玲玲，周洋，張加，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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