本發明專利技術公開了一種檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-451，其miRNA序列為：?aaaccguuaccauuacugaguu。本發明專利技術還同時公開了上述標記物miR-451的用途，制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。試劑盒包括反轉錄系統和引物系統/引物探針系統；反轉錄系統包括反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；引物系統由miR-451的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物組成；引物探針系統由miR-451的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物和探針以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針組成。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術和醫學領域，涉及ー種卵巢癌腫瘤的生物標記物-血清microRNA-451 (miR-451)，及其篩選方法和在輔助卵巢篩查與臨床診斷中的應用。
技術介紹
卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生埴器官常見的腫瘤之一,大多數是由于卵巢上皮細胞和包涵囊腫組織上皮細胞在多種致癌因子作用下，發生了基因突變，致使細胞增生失控。卵巢癌是死亡率極高的婦科惡性腫瘤，其組織學形態多種多祥，是ー類高度異質性的腫瘤，具有發病率高、但病程進展緩慢、早期癥狀不易察覺；且侵襲轉移能力較強、自然生存期長等特點。在臨床檢查中，多采用CA-125水平檢測、超聲檢查、以及聯合CA-125動態監測和盆腔超聲檢查及彩色多普勒血流顯像等檢測方法盡可能的提高卵巢檢出率。但目 前80%的卵巣癌病人發現時已是中晩期(II -IV)，采取腫瘤細胞減滅術以及化療患者的5年存活率僅為20%左右，且治療比較復雜，預后效果比較差。雖然早期診斷及輔助化療和激素治療使得卵巣癌的死亡率有所降低，但在導致女性死亡的惡性腫瘤中卵巢癌仍居世界前列。MiRNA(MicroRNA)是ー類生物體內自然形成的小分子非編碼RNA，參與調節其特異靶基因的表達，從而控制蛋白的產生，具有調節發育時序，細胞増殖，分化，代謝，凋亡與應激以及參與脊椎動物心臟、肌肉以及神經系統的形成，同時調控腫瘤發生的功能。約50%的已知人類miRA基因定位于和腫瘤相關的染色體區域，而不斷累積的研究成果也已充分證實miRNA的異常表達與腫瘤的發生，發展密切相關。高通量測序是基于傳統的Sanger測序的基礎上發展而來的分子生物學的分析方法之ー是，雖然此技術建立時間不長，但其發展速度相當快。該技術能夠對數百萬個分子進行同時測序。這使得對ー個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能。高通量測序的具有傳統測序法達不到的優點，首先，它是利用芯片技術進行測序，可以在數百萬個點上同時閱讀測序，把利用平行處理的方略讀取結果，通量較高；其次，高通量測序具有精確地樣本定量功能，其原理為樣本的DNA或者RA被測序的次數反應了在樣品中的豐度；同時高通量測序的成本相對較為低廉。對于miRNA序列較短、同源性高，利用芯片檢測非常困難。而利用高通量技術不僅能夠解決此問題，而且能夠發現新的miRNA。利用此技術對卵巢腫瘤患者血清與健康血清樣本分別進行測序，并對比其序列組成以及表達譜特征，對于發現生物標記物用于卵巢疾病的早期診斷有重要的意義。生物標記物是指能將機體的生理和病理狀態區分開來的生物分子。篩選到可用于腫瘤早期發現、早期診斷的生物標記物可大大提高腫瘤患者的臨床治療效果。最新數據顯示腫瘤組織普遍具有特征性的miRNA表達譜，即指腫瘤細胞某幾種miRNA的表達水平常與同一組織中的正常細胞存在顯著差異，而特征性的miRNA異常表達可望成為用于腫瘤的診斷、病理分級、臨床分期、療效與預后的生物標記物，顯示了良好的臨床應用前景。近年來研究人員發現在血漿和血清中也存在獨立于細胞之外并且即使在嚴酷環境下也能明顯保持穩定的miRNA分子，而作為生物檢測樣本，血清具有取材方便、無創傷性、并可連續的體外檢測的優點，使得基于miRNA定性和定量檢測技術尋找癌癥特異性的血清miRNA作為分子標記的方法比傳統的蛋白分子標記方法將更加有效，進而可以克服分子標記在抗體制備和定量分析上發展所遇到的瓶頸。因此，開發ー種可輔助卵巣癌篩查和診斷的血清miRNA作為生物標記物，具有廣泛的科研價值和臨床應用前景。目前已有實驗證實，microRNA在血液中被有效地保護，使其免受在血液中大量存在的RNase的降解,表現出高度的穩定性。對于血液microRNA能否作為ー種無創性檢測手段，目前的研究主要集中在癌癥的早期診斷方面。然而，目前還沒有將血清/血漿microRNA應用于卵巣疾病的輔助判斷、危險度評價等方面的報道，若能篩選與卵巢組織病理狀態有關的特異或異常表達的血清/血漿microRNA作為疾病檢測的生物標志物，并研制相應的檢測試劑盒，將會大大提升卵巢腫瘤疾病的檢測水平。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供ー種具有較高靶向性、穩定性及高效率檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-451及其用途。為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-451，其 miRNA 序列為miR-451 :aaaccguuaccauuacugaguu。本專利技術還同時提供了上述血清學生物標記物的用途制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。作為本專利技術的血清學生物標記物的用途的改進試劑盒包括反轉錄系統和引物系統/引物探針系統(即，引物系統和引物探針系統任選其一)；反轉錄系統包括反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；引物系統由miR-451的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物以及miR_16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物組成；引物探針系統由miR-451的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物和探針以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物及探針組成。作為本專利技術的血清學生物標記物的用途的進ー步改進試劑盒還包括擴增系統；擴增系統包括含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液。備注說明該擴增系統僅在引物探針系統中被用到。作為本專利技術的血清學生物標記物的用途的進ー步改進檢測該標志物(標記物)的技術為基于莖環的反轉錄-熒光定量PCR技木。作為本專利技術的血清學生物標記物的用途的進ー步改進miR_451的莖環結構反轉錄引物，由以下核苷酸序列組成GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA。作為本專利技術的血清學生物標記物的用途的進ー步改進熒光定量PCR技術為DNA染料法。基于DNA染料法的熒光定量PCR檢測方法，其中所使用的miR-451的cDNA擴增引物為miR-451 PCR 正向引物CGCGGAAACCGTTACCATTA ;miR-451 PCR 反向引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT ；基于TaqMan探針法的熒光定量PCR檢測方法，其中所使用的引物為上述PCR引物(miR-451的cDNA擴增引物)，其中所使用的探針由以下核苷酸序列組成miR-451 熒光探針(6-FAM) ACTGGATACGACAACTCA (MGB)。備注說明以上括號內的內容代表探針合成方式。 在熒光定量PCR檢測方法中，使用保守性miRNA (miR-16)作為內參照基因，其序列、莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針為夕U uauugcacuugucccggccugu ；莖環結構反轉錄引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA ；miR-16PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ；miR-16PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；miR-16 熒光探針(6-FAM) TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。本專利技術提供了一種檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物microRNA的篩選方法，對卵巣癌血清及正常血清進行solexa/illumina高通量測序，根據其表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR？451，其特征是miRNA序列為：miR？451：aaaccguuaccauuacugaguu。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：丁先鋒，紀婷，孟麗，黃志雄，
申請(專利權)人：浙江理工大學，
類型：發明
國別省市：
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