煙草抗番茄黃化曲葉病毒的體細胞無性系突變體的離體篩選方法技術

本發(fā)明專利技術涉及煙草抗番茄黃化曲葉病毒的體細胞無性系突變體的離體篩選方法，屬于生物技術領域。以含有番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）侵染性克隆的農桿菌轉化煙草葉片，使TYLCV在煙草離體細胞內大量復制而產生病毒篩選壓力，通過長時間的組織培養(yǎng)誘發(fā)體細胞無性系突變體，突變體植株及其后代植株接種攜帶TYLCV的煙粉虱進行連續(xù)篩選，獲得表型正常、無病癥的抗TYLCV煙草。本發(fā)明專利技術有效克服了病毒或病毒粗提取物不能直接加到培養(yǎng)基里作為選擇壓進行離體篩選抗病毒突變體的缺陷，為培育抗病毒材料提供了一種新方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，屬于生物
，專用于作物(煙草)抗番茄黃化曲葉病毒細胞工程育種。
技術介紹
番爺黃化曲葉病毒病是由煙粉風攜帶傳播番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellowleaf curl virus, TYLCV)引起的,危害番爺、煙草等重要經濟作物生產的一種雙生病毒病(劉玉樂，蔡健和，李冬玲，等.中國番茄黃化曲葉病毒一雙生病毒的一個新種.中國科學，C輯，1998，28:148-153 ；Zhou X P, Xie Y, Zhang Z K. Molecular characterization of a distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan, China.Archives of Virology, 2001, 146:1599-1606)。該病最早于 1964 年在以色列發(fā)生,之后迅速擴散到歐洲、亞洲、非洲以及大洋洲等地區(qū)，給番茄生產造成了巨大的損失。自2002年傳入我國以來，TYLCVD已在云南、廣東、廣西、上海、浙江、江蘇、河南、山東等地蔓延，嚴重影響當地農作物的生產，甚至會導致絕收(國艷梅，杜永臣，王孝宣，高建昌.番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的研究進展，中國農業(yè)科技導報，2009，11 (5) : 30-35)。由于TYLCV是通過煙粉虱攜帶傳播的，所以化學防治是最直接有效的方法，但隨著大量化學藥劑的使用，煙粉虱的抗藥性越來越強，即使藥效很好，也會因大量的使用，對人畜和環(huán)境造成影響，因此篩選TYLCV抗源，從而培育高抗TYLCV的品種具有十分重要的意義。但栽培品種中缺乏有效的抗源基因，僅有一些種質表現為耐病，高抗TYLCV基因都存在于近緣野生種質中(Maruthi M. N. , Czosnek H. , Vidavski F·，et al. Comparison ofresistance to tomato leaf curl virus (India) and tomato yellow leaf curl virus(Israel) among Lycopersicon wild species, breeding lines and hybrids. EuropeanJournal of Plant Pathology, 2003, 109 (I):1-11.)。體細胞無性系變異是指通過組織培養(yǎng)過程獲得再生植株，再生植株表現與親本不同特征的現象(Larkin P J. Scowcroft W R. Somaclonal variation- a novelsource of variability from cell culture for plant improvement. Theoretical andApplied Genetics, 1981，60:197-214.)。體細胞無性系變異在某些植物中發(fā)生的概率高達30%-40%，某一性狀的變異率在O. 2%-3%之間(豐先紅，李健，羅孝貴.植物組織培養(yǎng)中體細胞無性系變異研究.中國農學通報，2010，26(14) :70-73.)。目前，體細胞無性系變異已經被廣泛應用于煙草、玉米、水稻等作物的種質創(chuàng)新，并獲得了有價值的育種突變體，包括抗病突變體(Carlson P S. Induction and isolation of auxotrophic mutantsin somatic cell culture of Nicotiana tabacum. scince, 1970, 168:487-489;陳啟峰，陳璋，王金陵.運用致病毒素篩選抗稻瘟質細胞突變體.遺傳學報，1993，( 4):340-347;趙曉明，李明山，宋秀英.通過組織培養(yǎng)篩選番茄抗早疫病.山西農業(yè)大學學報，1996，16 (4) : 350-353)。其中，大量的抗病突變體是以病原菌產生的毒素作為選擇壓篩選獲得。而通常情況下，植物病毒只有在寄主活體內才能保持其活性，所以病毒或病毒粗提取不能直接加到培養(yǎng)基里作為選擇壓進行植物抗病毒突變體的離體篩選。TYLCV侵染性克隆是將TYLCV基因組DNA-A串聯(lián)重復序列克隆到植物表達載體T-DNA區(qū)，通過農桿菌介導將T-DNA整合到植物細胞而實現TYLCV基因的轉錄和表達，主要用于TYLCV侵染宿主進行瞬時表達研究(Zhang H, Gong H R, Zhou X P. Molecularcharacterization and pathogenicity of tomato yellow leaf curl virus in China.Virus Ggenes, 2009，39:249-255)。為了獲得抗TYLCV煙草突變體，本專利技術以含有TYLCV侵染性克隆的農桿菌轉化煙草，通過農桿菌T-DNA將TYLCV的DNA序列整合到煙草基因組內，使TYLCV在植物離體細胞內大量合成和復制，產生病毒篩選壓力，借助組織培養(yǎng)過程中產生的體細胞無性系變異，從而實現煙草抗TYLCV突變體的篩選。到目前為止，未見利用侵染性克隆轉化煙草篩選獲得抗病毒突變體的報道。三
技術實現思路
技術問題 本專利技術涉及，其目的在于克服離體的病毒或病毒粗提物無活性而無法直接加入培養(yǎng)基作為選擇壓篩選體細胞無性系突變體的缺陷，為獲得植物抗病毒材料提供新的方法。技術方案 煙草抗番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的體細胞無性系突變體的離體篩選方法，包括 1)以含有番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)侵染性克隆的農桿菌轉化煙草葉片； 2)轉化后的煙草葉片通過長時間的組織培養(yǎng)誘發(fā)體細胞無性系突變體； 3)突變體植株及其后代植株接種攜帶TYLCV的煙粉虱連續(xù)篩選，獲得表型正常、無病癥的抗TYLCV煙草。本專利技術所述的方法，具體步驟如下 1)將消毒的普通煙草葉片剪成Icm2大小，以0D_=0.3-0. 4的含有番茄黃化曲葉病毒侵染性克隆PTYjOl的農桿菌浸泡10 min，置于MS+l.Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA共培養(yǎng)基上、25°C黑暗培養(yǎng)2天； 2)葉片置于選擇培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA +500mg/L 頭孢霉素+50mg/L卡那霉素)上、25°C、16/8 h光照周期培養(yǎng)，每隔20天繼代一次，連續(xù)繼代3-4個月； 3)將愈傷組織上長出的I-2 cm新芽切下，轉入生根培養(yǎng)基(1/2 MS +500mg/L頭孢霉素)上生根培養(yǎng)； 4)表型正常的再生苗經TYLCV特異引物進行PCR鑒定為陽性后，移栽溫室內，每株接種50頭攜帶TYLCV的煙粉虱，收獲整個生育期都不體現病癥的植株自交種子； 5)自交種子播種于溫室內再經攜帶TYLCV的煙粉虱取食，篩選整個生育期都不體現病癥的植株。TYLCV特異引物為5’-CGCCCGTCTCGAAGGTTC-3’5’-GCCATATACAATAACAAGGC-3’ ； PCR鑒定方法為 94°C預變性4min，94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸I min，共30個循環(huán)，最后72°C下延伸10 min，取IOyL PCR產物在質量百分比為1%瓊脂糖膠上進行電泳檢測，結果顯示本文檔來自技高網...

【技術保護點】
煙草抗番茄黃化曲葉病毒的體細胞無性系突變體的離體篩選方法，？其步驟包括：1)？以含有番茄黃化曲葉病毒TYLCV侵染性克隆的農桿菌轉化煙草葉片；？2)？轉化后的煙草葉片通過長時間的組織培養(yǎng)誘發(fā)體細胞無性系突變體；3)？突變體植株及其后代植株接種攜帶TYLCV的煙粉虱連續(xù)篩選，獲得表型正常、無病癥的抗TYLCV煙草。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：余文貴，張保龍，郭佳茹，袁洪波，陳天子，楊郁文，
申請(專利權)人：江蘇省農業(yè)科學院，
類型：發(fā)明
國別省市：