本發明專利技術屬于微生物發酵工程領域，具體是一種熱纖梭菌高密度培養的方法。其特征是以GS-2培養基為初始培養基，通過多元數理統計方法優化發酵培養基，快速高效的提高熱纖梭菌的菌體濃度。本發明專利技術的優點在于提供了一種快速獲取熱纖梭菌大量菌體濃度的發酵培養基，為后續生產轉化纖維素為生物乙醇效率特別高的纖維小體做鋪墊。本發明專利技術所得熱纖梭菌的菌體密度比初始培養基提高6～9倍，瓶裝條件下OD600達到8.85，發酵罐中OD600達到12.7。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物發酵工程領域，具體是熱纖梭菌高密度培養的方法。
技術介紹
隨著全球能源和環境危機的加劇，尋求替代能源已成為許多國家的研究熱點，這其中清潔，可再生的生物能源是替代能源研究的重要方面，而生物こ醇是最有發展前景的液體生物能源之一，然而目前生物こ醇還主要來自糖類和淀粉發酵，面對世界人ロ的急劇膨脹和糧食短缺，用糧食生產酒精的發展將受到諸多限制(王丹，林建強等，2002)。纖維素是地球上最豐富的可再生資源，但只有極少數被有效利用，絕大部分被作為廢物棄置在環境中，反而造成一定的環境污染，比如城市垃圾。所以用纖維素物料生產新型生物燃料，因為具有重大戰略意義而引起世界各國的廣泛重視(聞志強，姜薇，2010)。但 是木質纖維素由于極其復雜的結構，導致其降解十分困難(Christian Weber & AlexanderFarwick et. al,2010)。嗜熱厭氧的熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)因能直接將纖維素轉化為こ醇而吸引了眾多研究者的注意力，該菌可從每摩爾葡萄糖對等物中產生出高達Imol的こ醇，有學者研究指出，熱纖梭菌是將纖維素直接轉化為こ醇的最有效菌之一(Lynd.et al，2002)。研究表明(Lamedr，1984)，熱纖梭菌中廣泛存在的纖維小體(cellulosome)是其能夠直接把纖維素轉化為こ醇的關鍵所在，因為纖維小體具有類似核糖體的大分子結構，能協調、有序、高效地降解纖維素。雖然當前廣泛使用的纖維素酶主要由木霉，青酶和曲霉等真菌產生和生產，然而真菌生產的纖維素酶主要是酸性纖維素酶，而細菌和放線菌產生的纖維素酶往往具有耐堿耐熱等獨特優點，其應用將大有前景。細菌的纖維素酶即以纖維小體的形式存在(黃俊，陳東，黃日波，2011)。熱纖梭菌是ー種高溫、厭氧、纖維素降解菌，能在60°C下快速生長，并產生大量的纖維小體分解纖維素、半纖維素為纖維ニ糖、木糖、木聚ニ糖等。其本身也能利用分解產生的小分子物質生產こ醇、こ酸、乳酸、CO2和h2。然而熱纖梭菌存在こ醇產量低和こ醇耐受性差等突出缺點，強烈抑制了纖維小體的高效表達。同時高能耗的前處理過程和纖維素酶本身高昂的價格極大的制約了纖維素生物質能源的利用，所以如果能有效提高纖維小體的表達水平，將對于降低纖維素酶的成本，以及進一歩降低纖維素生物質的利用成本具有重要意義。熱纖梭菌的高密度培養可能是實現該目的的方法之一。高密度發酵是快速獲取菌體及其主要代謝物的主要方法，也是商業化生產的前提條件，對于提高發酵エ業中的生產強度，降低生產成本具有重要意義(陳保立，王世立等，2009)，然而熱纖梭菌的高密度培養還未見報道，本專利技術將填補此方面的空白。
技術實現思路
本專利技術開發了熱纖梭菌高密度培養的エ藝。所要解決的技術問題可以通過以下方案來實現本專利技術以纖維素質生物質ニ糖降解物，如纖維ニ糖或木聚ニ糖為原料，發酵法直接高密度培養，主要包括以下步驟I.發酵種子液的制備。種子液培養基為GS-2 =KH2PO4 I. 5g/L，K2HPO4 (anhydrous) 2. 9g/L,氮源 2. I g/L, MgCl2 6H20 I. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L,FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteine hydrochloride I. Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 5. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og/L, Yeast extract 6.Og/L, Sodiumcitrate 2H20 3. Og/L配制發酵培養基，初始pH為7. 4。2.高密度發酵培養基配方KH2PO4 I. 2g/L, K2HPO4 (anhydrous) 6. Og/L,氮源5. Og/L, MgCl2 6H20 2. 49g/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 2. Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 20. Og/L, Morpholinopropane sulfonicacid (MOPS) 10. Og/L, Yeast extract 12. Og/L, Sodium citrate 2H20 0. 752g/L 配制發酵培養基，并滅菌。其中，碳源為纖維素質生物質，氮源為有機或無機氮源；滅菌前調節PH為8.0 ;若需擴大底物濃度，則仍應保持碳氮比為5 I。3.接種。將培養好的種子液按一定比例接入厭氧瓶或發酵罐中。4.培養。溫度60°C，厭氧，罐或瓶壓為-0. IMPa 0. IMPa,間歇性或低速攪拌。高底物濃度(碳源濃度大于15g/L)發酵時應控制pH恒定為7. 0左右。發酵方式可采用分批，補料分批，連續或半連續等。5.經24h_48h后菌體濃度達到最大,瓶裝條件下0D_達到8. 85，發酵罐中OD6tltl達到 12. 7。按照以上步驟，熱纖梭菌高密度培養是本
的技術人員能夠實現的。本專利技術具有顯著優勢厭氧條件可省去發酵過程中通入氧氣或壓縮空氣所需的昂貴能源消耗；高溫發酵不易發生污染，可減少冷卻用水，這些都將進一歩降低熱纖梭菌高密度培養的生產成本。附圖說明無具體實施例方式實施例I :100ml厭氧瓶發酵I.用ImL注射器取100 ii L C. thermocellum JYTOl的甘油管菌種,接種于裝有5mL種子培養基的厭氧瓶中，60°C恒溫培養，活化菌種。2.將活化好的C. thermocellum JYTOl菌液3mL接種于50mL種子培養基中，60°C，恒溫培養箱中培養24小時，得到一級種子液。3.按配方“KH2PO4 I. Og/L, K2HPO4(anhydrous)6. Og/L, urea 5. Og/L, MgCl2 6H202.49g/L, CaCl2 2H20 135mg/L, FeSO4 6H20 5.Omg/L, Cysteine hydrochloride2.Og/L, Resazurin 2.Omg/L, cellobiose 20.Og/L, Morpholinopropane sulfonicacid (MOPS) 10. Og/L, Yeast extract 10. Og/L, Sodium citrate 2H20 0. 752g/L” 配制發酵培養基，調整初始pH為8. O。分裝培養基IOOmL于300ml厭氧瓶中，不斷通入氮氣排凈瓶內空氣，并用聚丁酯塞密封，以保證瓶內厭氧環境。115°C，15min濕熱滅菌。其中，鈣、鎂、鐵鹽分別配成IOOX母液于滅菌后加入。4.約24h后菌體濃度達到最大，停止培養獲得發酵液中OD6tltl為8. 85.實施例2:5L發酵罐發酵I.按照實施例I所述方法制備C. thermocellum JYTOl 一級種子液200ml,并計算接種量為I : 10，發酵液總體積為2L時各自所需體積。2 按配方“ KH2PO4 I. Og/L, K2HPO4 (anhydrous) 6本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種熱纖梭菌高密度培養的方法，其特征是以GS？2培養基為初始培養基，通過高溫，厭氧發酵，在反應器中實現熱纖梭菌的高密度培養。主要包括以下步驟：1)菌種熱纖梭菌(Clostridium？thermocellum)JYT012)培養基的制備種子液培養基為：KH2PO4？1.5g/L，K2HPO4(anhydrous)2.9g/L，氮源2.1g/L，MgCl2·6H2O？1.0g/L，CaCl2·2H2O？150mg/L，FeSO4·6H2O？1.25mg/L，Cysteine？hydrochloride？1.0g/L，Resazurin？2.0mg/L，碳源5.0g/L，Morpholinopropane？sulfonic？acid(MOPS)10.0g/L，Yeast？extract？6.0g/L，Sodium？citrate·2H2O？3.0g/L配制發酵培養基，初始pH為7.4。高密度發酵培養基配方：KH2PO4？1.2g/L，K2HPO4(anhydrous)6.0g/L，氮源5.0g/L，MgCl2·6H2O？2.49g/L，CaCl2·2H2O？150mg/L，FeSO4·6H2O？1.25mg/L，Cysteine？hydrochloride？2.0g/L，Resazurin？2.0mg/L，碳源20.0g/L，Morpholinopropane？sulfonic？acid(MOPS)10.0g/L，Yeast？extract？12.0g/L，Sodium？citrate·2H2O？0.752g/L配制發酵培養基，并滅菌。滅菌前調節pH為8.0。3)接種將培養好的種子液按1∶20？1∶60(V∶V)比例接入厭氧瓶或發酵罐中。4)培養溫度50？70℃，厭氧，罐或瓶壓為？0.1MPa～0.1MPa，攪拌轉速為60？100rpm。高底物濃度(碳源濃度大于15g/L)發酵時應控制pH為6.0？8.0。培養時間為12h？48h。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：崔球，朱新術，張華仁，張景濤，
申請(專利權)人：中國科學院青島生物能源與過程研究所，
類型：發明
國別省市：
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