他克莫司粗品的純化方法技術

本發明專利技術提供一種他克莫司粗品的純化方法，將他克莫司粗品經第一有機溶劑溶解并超聲振蕩后，采用快速濾紙抽濾，之后把抽濾所得的濾液即樣品溶液通過制備型高速逆流色譜儀進行連續純化并收集含他克莫司的主峰，然后合并收集到的收集液，接著依次進行減壓濃縮、有機溶劑萃取、濃縮萃取液并重結晶以獲得產品。本發明專利技術不僅能夠獲得高純度的他克莫司，且具有較高的純化收率，從而可降低工業化的成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種醫藥生物
的純化方法，尤其涉及一種。
技術介紹
他克莫司是一種新型強效的大環內酯類免疫抑制劑，最早由日本藤澤藥品工業公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分離到的筑波霉菌的發酵液中提取得到；1989年他克莫司首次應用于臨床肝臟移植；1991年日本開發的名為普樂可復(Prograf)他克莫司膠囊劑和注射劑正式上市，用于原發性肝移植和腎移植的排斥反應治療，后又被批準用于骨髓移植。目前他克莫司制劑已在日本、美國、英國、德國、加拿大、丹麥、法國、意大利、西班牙、愛爾蘭等80多個國家上市，廣泛應用于肝臟、胰腺、腎臟、心臟和肺等實體器官移植后的抗排異治療。1999年他克莫司軟膏投放日本市場，用于治療成人的特應性皮炎。 此外，他克莫司對牛皮癬、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞氏病、變應性皮炎、類風濕性關節炎以及多發性硬化病等自身免疫病有療效。主要地，由于他克莫司來源于發酵產品，發酵過程同時也產生了多個他克莫司類似物，包括二氫他克莫司和子囊霉素等雜質；這些雜質和他克莫司結構極為相似，物理化學性質相近，通過常規的純化技術難于獲得較高純度的原料藥，從而難以滿足市場需要。現有關于他克莫司分離純化的文獻中雖然均揭露了用吸附樹脂或改性硅膠來精制他克莫司，但存在著純化收率低、工業化成本高的問題。次要地，高速逆流色譜技術(high-speedcounter-current chromatography,HSCCC)是基于流體動力學原理開發的一種新興無固體載體的高效液-液分配色譜技術，已成功應用于多種天然中藥和活性成分分離，并開始在微生物發酵藥物分離過程中應用。隨著高速逆流色譜技術的發展，制備型逆流色譜儀已開始得到應用，但如何節約溶劑并進行連續生產并未見相關報道。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種，不僅能夠獲得高純度的他克莫司，且具有較高的純化收率，從而可降低工業化的成本。本專利技術是通過以下技術方案解決上述技術問題的一種，該純化方法包含如下具體步驟(I)用第一混合有機溶劑溶解他克莫司粗品以獲得濃度為5_40g/L他克莫司粗品溶液，之后將該他克莫司粗品溶液進行超聲振蕩，超聲頻率40KHz，超聲時間30-60min ;所述第一混合有機溶劑由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100 110:340 380:275 305的體積比混合而成；(2)將步驟(I)超聲結束后的他克莫司粗品溶液進行快速濾紙抽濾，抽濾所得的濾液即樣品溶液采用制備型高速逆流色譜儀進行連續純化并收集含他克莫司的主峰；( 3 )合并步驟(2 )收集所得的收集液，之后依次進行減壓濃縮、有機溶劑萃取、濃縮萃取液并重結晶以獲得產品；進一步地，所述步驟(2)中制備型高速逆流色譜儀的色譜條件為制備型高速逆流色譜儀上海同田生物技術有限公司生產的TBE-5000A型制備型高速逆流色譜儀；溶劑體系單獨配置流動相與固定相；其中流動相為所述第一混合有機溶劑；固定相為第二混合有機溶劑，且該第二混合有機溶劑由體積比為13 16:11 13. 5:0. 9 1.1的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇組成；進樣方式連續進樣； 主機轉速450_500rpm；流動相流速20_25ml/min；檢測波長254nm;制備溫度20-25°C ;在線檢測軟件N2000色譜工作站。進一步地，所述步驟(2)中采用制備型高速逆流色譜儀純化的過程為將所述固定相以75-100ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然后開啟速度控制器使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到450-500rpm時，以20_25ml/min流速泵進該流動相,待流動相流出且兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取所述樣品溶液進樣200ml，然后分段收集含他克莫司的主峰。進一步地，所述第二混合有機溶劑的制備過程為將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比13 16:11 13. 5:0. 9 I. I混合攪拌20_30min，之后采用40KHz頻率的超聲波脫氣20-30min即可。進一步地，所述步驟(3)中的有機溶劑為乙酸乙酯或乙酸丁酯。進一步地，所述步驟(3)中重結晶的具體操作為在濃縮后的萃取液中加入熱乙醚，攪拌溶解后置于0-5°C結晶，結晶獲得的晶體采用冷乙醚洗晶，之后將晶體進行50-60°C真空干燥，得到產品。本專利技術的有益效果在于I、通過本專利技術純化方法的操作步驟，不僅能夠獲得高純度的他克莫司，且具有較高的純化收率,從而可降低工業化的成本；2、改變了常規高速逆流色譜單次進樣的缺點，采用連續進樣的方式，使得一次逆流可以分離的樣品量得以大大提升；3、另外，在連續的逆流生產過程需要大量的流動相，只需要少量固定相，本專利技術通過改變常規高速逆流色譜利用萃取分層同時配制流動相和固定相的方式，而采用了根據需要單獨配制固定相和流動相，不僅節省了大量溶劑，且因溶劑無需靜置，從而節省了時間。具體實施方式本專利技術，該純化方法包含如下具體步驟(1)用第一混合有機溶劑溶解他克莫司粗品以獲得濃度為5-40g/L他克莫司粗品溶液，之后將該他克莫司粗品溶液進行超聲振蕩，超聲頻率40KHz，超聲時間30-60min ;第一混合有機溶劑由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100 110:340 380:275 305的體積比混合而成；(2)將步驟(I)超聲結束后的他克莫司粗品溶液進行快速濾紙抽濾，抽濾所得的濾液即樣品溶液，之后將固定相以75-100ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然后開啟速度控制器使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到450-500rpm時，以20_25ml/min流速泵進流動相,待流動相流出且兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取所述樣品溶液進樣200ml，分段收集含他克莫司的主峰；(3)合并步驟(2)收集所得的收集液并進行減壓濃縮，將獲得的濃縮液采用乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取，之后將萃取液進行濃縮，接著在濃縮后的萃取液中加入熱乙醚，攪拌溶解后置于0-5°C結晶，結晶獲得的晶體采用冷乙醚洗晶，之后將晶體進行50-60°C真空干燥，得到產品。其中，步驟(2)中制備型高速逆流色譜儀的色譜條件為制備型高速逆流色譜儀上海同田生物技術有限公司生產的TBE-5000A型制備型高速逆流色譜儀； 溶劑體系單獨配置流動相與固定相；其中流動相為第一混合有機溶劑；固定相為第二混合有機溶劑，且該第二混合有機溶劑由體積比為13 16:11 13. 5:0. 9 I. I的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇組成；進樣方式連續進樣；主機轉速450-500rpm；流動相流速20_25ml/min；檢測波長254nm；制備溫度20-25°C ；在線檢測軟件N2000色譜工作站。且第二混合有機溶劑的制備過程為將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比13 16:11 13. 5:0. 9 I. I混合攪拌20_30min，之后采用40KHz頻率的超聲波脫氣20-30min 即可。為了對本專利技術純化方法進行進一步地闡述說明，申請人給出了以下幾個實施例，且在各實施例中所采用的儀器和試劑TBE-5000A型制備型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司);8823B紫外檢測器(北京賓達英創科技有限公司)；N2000色譜工作站(浙江智達信息工程有限公司);HX-2050恒溫循環器(北京博醫康實驗儀器有限公司);L本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種他克莫司粗品的純化方法，其特征在于：該純化方法包含如下具體步驟：（1）用第一混合有機溶劑溶解他克莫司粗品以獲得濃度為5？40g/L他克莫司粗品溶液，之后將該他克莫司粗品溶液進行超聲振蕩，超聲頻率40KHz，超聲時間30？60min；所述第一混合有機溶劑由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100～110:340～380:275～305的體積比混合而成；（2）將步驟（1）超聲結束后的他克莫司粗品溶液進行快速濾紙抽濾，抽濾所得的濾液即樣品溶液采用制備型高速逆流色譜儀進行連續純化并收集含他克莫司的主峰；（3）合并步驟（2）收集所得的收集液，之后依次進行減壓濃縮、有機溶劑萃取、濃縮萃取液并重結晶以獲得產品。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：溫耀明，鄭衛，肖麗華，樂占線，莊鴻，
申請(專利權)人：福建省微生物研究所，
類型：發明
國別省市：