本發明專利技術描述用于哺乳動物細胞培養以及多肽產生的優化培養基。該細胞培養基的特征在于低鈉鉀離子比，本發明專利技術還涉及用這類細胞培養基產生多肽的方法。在另一方面，該多肽產生方法還可以包括溫度變動和/或pH變動來進一步優化生長和產物產率。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及生物技術的一般領域，尤其涉及細胞的培養及其在以エ業規模生產多肽中的用途。本專利技術提供細胞培養基，其適合用于培養具有高細胞存活率(viability)的細胞，優選如CHO細胞的哺乳動物細胞，其特征在于它們的鈉離子與鉀離子的摩爾比。在用于尤其是通過在哺乳動物細胞培養系統中重組表達多肽來產生多肽時，尤其是以エ業規模來產生多肽時，本專利技術的細胞培養基允許獲得高多肽生產力。
技術介紹
在過去二十年中，用重組技術制備多肽已發展為標準方法。通過克隆編碼各多肽的基因、然后用該待表達的基因轉化適宜的表達宿主、最后產生和純化所獲得的重組多肽 在重組DNA技術后使用生物工程領域中發展的產生方法，制藥產業中已制備了數目越來越多的藥物活性化合物。這類生物產物包括單克隆抗體，其已發展為包括自身免疫病、炎性障礙、免疫抑制、腫瘤學等的多種醫學領域中重要的治療選擇。這類生物來源藥物的發展需要以エ業規模生產，從而提供大量重組多肽。優選的表達系統是哺乳動物細胞培養物，其優于大多數其他基于昆蟲細胞、酵母等的真核系統，或甚至傳統的原核表達系統。但是，尤其是在エ業規模，哺乳動物細胞培養包括巨大的挑戰。用于哺乳動物細胞培養的生產設施需要徹底優化許多方法條件。用于控制總體產生方法的最重要的方法參數之一是在其中培養細胞并進行多肽產生的培養基。適宜的細胞培養基必須為細胞培養物提供所有必需營養物，這在不向培養基中加入動物來源的成分(如血清或蛋白質，例如生長因子)時尤其困難。因此，研發了多種不同的細胞培養基。在一些情況下，焦點在一般組成上，且提出了具有多種不同物質的培養基(US5 122 469,EPO 481 791,EPO 283 942)。在其他情況下，提出了用特定成分改善細胞培養。主要目標是改善細胞的生長或存活，或改善重組表達的多肽的數量和質量?，F有技術文件中提到的具體方面是特定痕量離子(例如WO 02/066603, EPO 872487，EPl 360 314 A2)、諸如抗壞血酸的維生素(例如US6 838 284)、糖類(EPl 543 106)或特定氨基酸的含量與其他特征組合(例如EPO 501 435，US5 830 761，US7 294 484)的貢獻等。細胞培養基中的主要離子及其濃度基本保持恒定，且未被考慮和改變。所有經典的培養基類型(例如DMEM、DMEM/F12、BME或RPMI 1640)都使用濃度范圍相對窄且固定的大量離子(一般而言)及單價陽離子Na+和K+(具體而言)。這與以下事實一致，大量離子(一般而言)及單價陽離子Na+和K+(具體而言)的離子平衡是幾乎所有哺乳動物細胞的普遍特性。更具體而言，鈉離子和鉀離子的跨膜梯度是哺乳動物細胞的基本特性，細胞內具有高濃度的鉀離子，而細胞外具有高濃度的鈉離子。鈉鉀泵是細胞膜的主要離子泵之一，其是生電泵，且有助于建立和維持鈉和鉀的跨膜離子梯度(Kaplan, Membrane cationtransport and control of proliferation of mammalian ceils. Annu Rev Physiol. ；40 19-41(1978))。該泵使用約30%的細胞能量，是細胞的主要耗能過程之一。許多基本的生物化學過程與鈉離子的電化學梯度偶聯，例如Na+/Ca+交換或氨基酸轉運入細胞。因此，細胞外的鈉離子和鉀離子濃度是具有重要意義的參數，其影響這些離子的跨膜梯度和細胞的基本狀態。根據哺乳動物細胞內部和外部的典型鈉離子濃度(Alberts等，MolecularBiology of the Cell (1994)),大多數情況下,選擇約145mM的鈉濃度，同時選擇約5mM的鉀離子濃度。對于大多數培養基類型，這導致鈉離子和鉀離子之間的比值在約20-30的范圍內(見下文表I和例如US5135866)。 只有很少的現有技術文件在描述適合用于哺乳動物細胞培養或重組蛋白質產生的細胞培養基時提到了鈉離子與鉀離子的具體比值。這些文件提出了具有特別高的比值的培養基組合物，US 5232848中在約30. 7的高范圍內，或在約25和35之間的范圍內，從而達到甚至更高的值(EP0 283 942，EPO 389 786)。其他培養基，如HAM’ s_F12或US2008/0261259中提出的確定成分的動物細胞培養基也明確提出了更高的值(例如在US2008/0261259中為27. 9至57. 5)。只有非常少的文件公開了具有低于20的鈉鉀離子比的培養基，如11. 5-30 (US7 294 484)或約15的比值(US6 180 401)。這些文件仍使用高于10的比值，且未將具體優勢分配給將該參數變為所提到的值。除了與特定離子間的離子平衡相關的作用外，還應考慮主要離子對培養基的總體重量摩爾滲透壓濃度的貢獻。大多數常規培養基(例如DMEM、MEM a或Fischer’s培養基)的特征在于高量的氯化鈉。WO 02/101019研究培養基中高含量的葡萄糖與利用更高重量摩爾滲透壓濃度的組合。通過減少或甚至徹底去除諸如氯化鈉的物質，從而維持重量摩爾滲透壓濃度在給定水平，達到了約2-40g/l之間的高葡萄糖濃度。鑒于以上挑戰和現有不足，エ業生物
中存在對改進的培養基的持續需要，該培養基允許以エ業規模產生重組多肽。專利技術概述本專利技術提供具有降低的Na+/K+比(即，低于約10的值的Na+/K+比)的細胞培養基。這是通過減少總鈉離子數目和増加總鉀離子含量的方式達到的。已發現，這種低比值產生了幾種有益作用，尤其是改善哺乳動物細胞的存活率、生長和生產力。因此，本專利技術提供用于哺乳動物細胞的培養及多肽產生的優化細胞培養基，其特征在于鈉離子與鉀離子(測量為摩爾含量)的比值在約10 I和約I : I之間，備選地在約8 I和約6 I之間。此特征的實現可以包括約50mM和約90mM之間的鈉離子濃度及約8mM和約12mM之間的鉀離子濃度。在另一方面，該細胞培養基的優化包括選擇約40mM和約IOOmM之間、備選地約50mM和約IOOmM之間的總氨基酸含量。此特征可以與總離子濃度和總氨基酸濃度之間約I.9至約4的特別低的摩爾比組合。在另一方面，本專利技術提供用本專利技術的細胞培養基培養哺乳動物細胞來產生希望的重組多肽的方法。該方法涉及在本專利技術的培養基中培養哺乳動物細胞，并表達重組多肽。該方法的一些實施包括培養條件，其中在培養期間變動溫度和/或培養基的pH至少一次。作為另ー選擇，通過補料分批方法來完成流加。希望的多肽產物包括糖基化的多肽，且尤其是抗體和抗體片段。用于本專利技術的方法的哺乳動物細胞優選選自CHO細胞、HEK細胞和SP2/0細胞。在另一方面，本專利技術涉及用于產生本專利技術的細胞培養基的方法，其中，將不同的成分相互混合。具體而言，向培養基組合物加入的氯化鈉的濃度可以在約7mM和約15mM之間。向培養基組合物加入的氯化鉀的濃度可以在約8mM和約12mM之間。 附圖簡述參考以下實施例和附圖將可以更好地理解本專利技術。但是，實施例并非旨在限制本專利技術的范圍。圖I作為培養時間的函數顯示搖瓶培養物中產生mAbl的CHO細胞克隆的活細胞密度(見實施例I)，使用本專利技術所述具有降低的Na+/K+比的培養基。此外本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：C·萊斯特，P·邁斯納，J·施密特，
申請(專利權)人：諾瓦提斯公司，
類型：
國別省市：
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