1,5-戊二胺的制造方法技術

本發明專利技術公開了一種利用微生物發酵的1,5-戊二胺制造方法，該微生物在染色體中具有LDC基因、并且抑制了副產物L-賴氨酸的產生。所述1,5-戊二胺的制造方法為利用了棒狀桿菌的1,5-戊二胺制造方法，該棒狀桿菌在染色體中具有編碼賴氨酸脫羧酶的基因，所述棒狀桿菌在培養中持續保持有50mU/mg蛋白以上的賴氨酸脫羧酶活性。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及利用發酵法制造1，5-戊ニ胺的方法。
技術介紹
聚酰胺(PA)是用作汽車行業、運動行業、生活時尚行業中所使用的一系列特殊塑料的原材料的重要聚合物組，ニ胺是所述聚酰胺的重要原材料単體成分。ニ胺和ニ羧酸縮合形成各種聚合物，此時，聚合物的特性由ニ胺和ニ羧酸的鏈長決定。通常，ニ胺以化學方式經過ニ羧酸的中間階段而由衍生自石油的材料來制造；或 者通過氨基酸的化學脫羧反應來制造(非專利文獻I)。考慮到石油價格的高漲，期望快速變化為下述方法通過發酵等生物技術方法從可再生資源來合成ニ胺。這里，利用發酵來制造作為碳數為5的ニ胺的1，5-戊ニ胺的方法受到廣泛關注。1，5-戊ニ胺別名為尸胺，是可以用作聚酰胺的原材料単體的化合物。另外，1，5-戊ニ胺是生物體內普遍存在的多胺，其生物合成體系正逐步被闡明(參考非專利文獻2)，作為其生物合成途徑的一部分，已知對L-賴氨酸的脫羧反應進行催化的L-賴氨酸脫羧酶(下面簡稱為LDC )。在傳統的利用發酵的1，5-戊ニ胺制造方法中，已知有以向微生物中導入LDC基因為基礎，利用重組大腸桿菌的發酵的制造方法(參考專利文獻I);在產賴氨酸的微生物的棒狀桿菌中，進ー步提高賴氨酸生產能力的方法(參考專利文獻2);切斷1，5-戊ニ胺降解體系的方法(參考專利文獻3);通過自主復制型載體提供賴氨酸脫羧酶的方法(參考非專利文獻3)。但是，在利用發酵的1，5-戊ニ胺制造方法中需要解決的問題較多，例如有這樣的問題在對向產L-賴氨酸的微生物的棒狀桿菌中導入了 LDC基因的微生物進行培養時，會生成副產物賴氨酸(參考非專利文獻4)。就是說，賴氨酸雖然是即將生物合成1，5_戊ニ胺時的前體，但是會出現未反應的賴氨酸在培養上清液中大量出現的問題。當如前所述生成副產物賴氨酸時，盡管可以制得前體，但1，5-戊ニ胺的發酵產率沒有提高，從而造成經濟上的問題。另外，在專利文獻3和非專利文獻3中，通過自主復制型載體提供LDC基因，但是由于在培養中需要添加昂貴的抗生物質等，因此為了在エ業規模中廉價地發酵生產1，5-戊ニ胺，期望使用染色體中帶有LDC基因的微生物。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本特開2002-223770號公報專利文獻2 :日本特開2004-222569號公報專利文獻3 :日本特表2009-531042號公報非專利文獻非專利文獻I :須山、金尾、「薬學雑誌」，1965年，第85卷，p. 513-533非專利文獻2 :セリアホワイ卜テ一バ一(Celia white tabor)、另外I人，！マイクロバイオロジカルレビユ一ズ(Microbiological Reviews) J,1985 年，第 49 卷，p. 81-99非專利文獻3 :タテノ等，アブライナマイクロバイオロジーアンナバイオテクノロジ 一(2009)、81 (1),115-21 (Tateno Appl MicrobiolBiotechnol (2009), 81(I), 115-21)非專利文獻4 :ミミツカ等，バイオサイエンスバイオテクノ ロジーバイオケミ力^(2007),71(9),2130-5(Mimitsuka Biosci Biotechnol Biochem(2007)，71(9)，2130-5)
技術實現思路
專利技術要解決的問題本專利技術的課題在于提供ー種1，5-戊ニ胺的制造方法，該制造方法利用了在染色體中具有LDC基因、并且副產物L-賴氨酸的生成得到抑制的微生物來進行發酵。解決問題的手段本專利技術人在利用發酵法的1，5-戊ニ胺的制造方法中，以抑制副產物L-賴氨酸的產生為目的，進行了專心的研究，結果發現，通過在1，5-戊ニ胺的發酵中使用棒狀桿菌，副產物L-賴氨酸的生成可以得到抑制，從而完成了本專利技術，所述棒狀桿菌在染色體中具有LDC基因，并且在培養中持續保持有50mU/mg蛋白以上的賴氨酸脫羧酶比活性。S卩，本專利技術由以下(I)至(12)構成。(I) ー種1，5_戊ニ胺的制造方法，其為利用了棒狀桿菌的1，5_戊ニ胺的制造方法，該棒狀桿菌在染色體中具有編碼賴氨酸脫羧酶的基因，所述制造方法的特征在干，所述棒狀桿菌在培養中持續保持有50mU/mg蛋白以上的賴氨酸脫羧酶活性。 (2)—種1，5_戊ニ胺的制造方法，其為利用了棒狀桿菌的1，5_戊ニ胺的制造方法，該棒狀桿菌在染色體中具有編碼賴氨酸脫羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述編碼賴氨酸脫羧酶的基因被連接至在對數増殖期中起作用的啟動子的下游。(3)上述(2)所述的方法，其特征在于，所述啟動子為divIVA基因啟動子。(4)上述(2)或(3)所述的方法，其特征在于，所述啟動子為選自下列(A)至(D)中任ー項的啟動子(A)由序列號2中所記載的堿基序列形成的啟動子；(B)由在序列號2所記載的堿基序列中，發生I個或多個堿基的置換、缺失、插入和/或添加后的堿基序列所形成的啟動子；(C)與由序列號2中所記載的堿基序列形成的啟動子或者其互補鏈的全體或一部分在嚴格條件下雜交的啟動子；(D)由與序列號2中所記載的堿基序列的序列一致性為至少80%以上的堿基序列所形成的啟動子。(5)上述(I)至(4)中任意一項所述的方法，其特征在干，所述編碼賴氨酸脫羧酶的基因是來源于大腸桿菌的基因。(6)上述(I)至(5)中任意一項所述的方法，其特征在于，所述編碼賴氨酸脫羧酶的基因為選自下列(A)至(D)中任ー項的基因，并且為編碼具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質的基因(A)由序列號I中所記載的喊基序列形成的基因；(B)由在序列號I所記載的堿基序列中，發生I個或多個堿基的置換、缺失、插入和/或添加后的喊基序列形成的基因；(C)與由序列號I中所記載的堿基序列形成的基因或者其互補鏈的全體或一部分在嚴格條件下雜交的基因；(D)由與序列號I中所記載的堿基序列的序列一致性為至少80%以上的堿基序列所形成的基因。(7)上述(I)至(6)中任意一項所述的方法，其特征在于，所述棒狀桿菌為提高了L-賴氨酸的生產性的棒狀桿菌。(8)上述(I)至(7)中任意一項所述的方法，其特征在干，所述棒狀桿菌具有突變型天冬氨酸激酶，該突變型天冬氨酸激酶是序列號3所記載的氨基酸序列中的第311位的氨基酸殘基被蘇氨酸以外的氨基酸置換而得到的。(9)上述(I)至(8)中任意一項所述的方法，其特征在于，所述棒狀桿菌的高絲氨酸脫氫酶活性降低或者缺失。(10)上述(9)所述的方法，其特征在于，所述棒狀桿菌通過基因插入突變而缺失高絲氨酸脫氫酶活性。( 11)上述(I)至(10)中任意一項所述的方法，其特征在干，所述棒狀桿菌為屬于棒狀桿菌屬(Genus Corynebacterium)的細菌。(12)上述(11)所述的方法，其特征在干，所述屬于棒狀桿菌屬(GenusCorynebacterium)的細菌為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。 附圖簡要說明[圖I]為示出了在對本專利技術實施例中所制作的棒狀桿菌CG4541菌株進行培養時，培養上清液中的葡萄糖濃度、賴氨酸濃度以及1，5_戊ニ胺(I, 5-PD)濃度隨時間變化的圖。[圖2]為示出了在對本專利技術的比較例中所制作的棒狀桿菌TM4552菌株進行培養時，培養上清液中的葡萄糖濃度、賴氨酸濃度以及1，5-本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.04.12 JP 2010-0916021.一種1，5-戍二胺的制造方法,其為利用了棒狀桿菌的1，5-戍二胺的制造方法,該棒狀桿菌在染色體中具有編碼賴氨酸脫羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述棒狀桿菌在培養中持續保持有50mU/mg蛋白以上的賴氨酸脫羧酶活性。2.—種1，5-戍二胺的制造方法,其為利用了棒狀桿菌的1，5-戍二胺的制造方法,該棒狀桿菌在染色體中具有編碼賴氨酸脫羧酶的基因，所述制造方法的特征在于，所述編碼賴氨酸脫羧酶的基因被連接至在對數增殖期中起作用的啟動子的下游。3.權利要求2所述的方法，其特征在于，所述啟動子為divIVA基因啟動子。4.權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述啟動子為選自下列(A)至(D)中任一項的啟動子 (A)由序列號2中所記載的堿基序列形成的啟動子； (B)由在序列號2所記載的堿基序列中，發生I個或多個堿基的置換、缺失、插入和/或添加后的堿基序列所形成的啟動子； (C)與由序列號2中所記載的堿基序列形成的啟動子或者其互補鏈的全體或一部分在嚴格條件下雜交的啟動子； (D)由與序列號2中所記載的堿基序列的序列一致性為至少80%以上的堿基序列所形成的啟動子。5.權利要求I至4中任意一項所述的方法，其特征在于，所述編碼賴氨酸脫羧酶的基因是來源于大腸桿菌的基因。6.權利要求I至5中任意一項所述的方法，其特征在于，所述編碼賴氨酸脫羧酶...

【專利技術屬性】
技術研發人員：澤井健司，渡邊志緒美，耳塚孝，澤井秀樹，
申請(專利權)人：東麗株式會社，
類型：
國別省市：