本發明專利技術提供一種Her2?neu抗原陽性腫瘤治療性疫苗的制備及應用。具體的，本發明專利技術提供了一種融合蛋白，該融合蛋白含有(a)腫瘤抗原Her2?neu胞外區元件和(b)熱休克蛋白元件。本發明專利技術還提供用所述融合蛋白致敏的樹突狀細胞以及相應的腫瘤治療性疫苗。試驗表明，體內應用本發明專利技術疫苗可以有效激發Her2?neu抗原特異性的免疫應答，有效地應用于Her2?neu陽性腫瘤。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物學和醫學領域，更具體地，本專利技術涉及一種Her2-neu抗原陽性腫瘤治療性疫苗的制備及應用，所述的融合蛋白包括熱休克蛋白與Her2-neu腫瘤抗原。
技術介紹
HER2/neu是人類腫瘤常發生改變的一個癌基因，與腫瘤的發生、發展密切相關，是表皮生長因子受體(Epidermal growth-factor receptor, EGFR)家族的第二位成員。表皮生長因子受體家族，也稱為!ER或ErbB2家族，在細胞信號轉導中發揮重要作用，是細胞生長、分化及存活的重要調節因子。人HER2/neu基因定位于17號染色體短臂，表達產物為分子量185KDa的單鏈跨膜 糖蛋白，即Pl85。pl85含有1255個氨基酸殘基，細胞內段具有酪氨酸激酶活性，是一種酪氨酸激酶受體。人HER2/neu蛋白由三部分組成細胞外區(extracellular domain,EO))、跨膜區和細胞內區(intracellular domain, IQ))。HER2/neu的EQ)包括4個亞結構域,亞結構域I和III是配體結合域，介導受體配體結合；亞結構域II和IV，富含半胱氨酸，在形成受體二聚體過程中起著重要作用。HER2/neu胞內信號途徑主要有2條，分別為絲裂原活化蛋白激酶(Ras-mitogen activated protein kinase, Ras/MAPK)、憐酸肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinasee/protein kinase B，PI3K/AKT)。一般認為，HER2/neu 的ECD與配體結合后，引發受體變構，導致其與相同的或其他EGFR家族成員形成同、異二聚體，隨后受配體被內吞并激活蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK),可使細胞膜內側的PTK活性顯著增加最終使癌細胞核內早期反應基因如原癌基因fos和jun等轉錄水平增加，促進有絲分裂等，從而能夠促進腫瘤形成、進展。而且，HER2/neu的過度表達能引起HER2/neu同二聚體的激活而無需配體的結合，從而引起不受控制的細胞生長和癌基因的轉化，因此，HER2/neu全蛋白或含有胞內段結構的片段應用于腫瘤疫苗中具有致瘤性和導致細胞不受控制的過度轉化的潛在風險。此外，HER2/neu蛋白主要在胚胎期的組織或器官中表達，而在成年組織或器官極少表達，因而機體免疫系統往往不能有效識別而導致免疫耐受。人類的多種腫瘤組織均存在HER2/neu過度表達，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發性腎細胞癌、胃癌、結直腸癌等。目前，手術、化療、放療等傳統療法對于早期ffiR2/neu陽性腫瘤具有一定的療效，但一方面化療、放療具有較大的副作用，另一方面由于許多腫瘤發現較晚，往往失去手術治療的最佳機會，所以通過增強機體免疫系統的抗腫瘤作用殺滅腫瘤細胞、達到治療腫瘤目的的免疫與基因療法作為腫瘤治療的一種新模式，成為腫瘤治療和免疫學研究的熱點。目前對于HER2/neu陽性腫瘤已有多種免疫和基因治療方案，如單克隆抗體、構建HER2/neu重組病毒疫苗、核酸疫苗、細胞因子的應用等。隨著HER2/neu氨基酸序列中T細胞表位被發現，并證實其可以在體外誘導出特異性的細胞免疫應答，以這些表位肽為基礎的腫瘤疫苗受到了研究者的關注，Disis采用完整P185蛋白不能有效誘導免疫應答，Georg采用HLA-A*0201限制性的九肽表位E75(Her2369_377)作為多肽疫苗可促發淋巴結陽性乳腺癌(NPBC)接受過治療的某些無疾病患者的特異性免疫反應，然而，目前尚沒有取得令人滿意的免疫效果。因此選擇適當的ffiR2/neu原癌基因片段區域是關鍵點，該片段既能夠暴露某些表位而誘導免疫應答，又能夠避免全長基因表達產物帶來潛在轉化危險。近年來，腫瘤抗原的發現、腫瘤免疫逃逸和抗腫瘤免疫應答機制的逐步闡明使人們認識到，如何有效提呈腫瘤抗原、激發機體對腫瘤抗原的應答能力是影響療效的一個關鍵因素。樹突狀細胞研究的深入不僅使基礎免疫學研究取得重要進展，而且給腫瘤的免疫治療帶來了希望。DC作為機體免疫系統中功能最強的專職性抗原遞呈細胞(Antigen-presenting cell, APC),能高效地攝取、加工處理和提呈抗原，并能夠顯著的激活初始型T細胞以啟動T細胞免疫應答反應,是機體免疫反應的始動者,處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。在受到抗原刺激后，DC經由循環或淋巴系統遷移至二級淋巴器官，并在此將所加工處理的抗原提呈給T細胞，在此過程中MHCI、II類分子、粘附分子等免 疫相關分子的高表達對DC功能的發揮起十分重要的作用。采用腫瘤抗原或其中的某些特異性表位肽致敏的DC作為腫瘤治療性疫苗已經在基礎及臨床研究中得到了證實，在前列腺癌、黑色素瘤、惡性淋巴瘤等腫瘤中取得了較好的療效，被認為是目前療效最有前景的腫瘤免疫治療方案。然而，單純采用小分子的抗原肽體外致敏DC的效率一般較低，DC在攝取小分子肽后，往往不能有效遞呈抗原并激發特異性的CTL(即細胞毒性T淋巴細胞)，因此如何增強DC對抗原的加工遞呈，以期更有效地激發腫瘤抗原特異性的免疫應答仍然是腫瘤免疫治療研究中亟待解決的問題。近年來有人嘗試利用輔助蛋白，如KLH(鑰孔蟲戚血藍蛋白)輔助腫瘤特異性的抗原去刺激DC，結果可增強抗腫瘤免疫應答。因此，發現并應用高效的輔助分子作為免疫佐劑(Adjuvant)，增強腫瘤抗原肽致敏DC的效能，從而誘導出更強的抗腫瘤免疫，是提高DC為基礎的腫瘤免疫治療的一個重要途徑。隨著免疫學研究的進展，新一代佐劑不斷被發現，如熱休克蛋白(Heat shockprotein, Hsp)、IFN- y、IL-12、LPS, lipid A和CpG等，其中Hsp以其所具有的獨特的生物學效應，受到越來越多的關注。當細胞遭受嚴重應激時，Hsp可從細胞內釋放出來，成為一種內在的“危險信號”向APC發出警示信息，并可活化DC，APC被Hsp趨化和激活后必將進一步激發免疫反應，引發抗原攝取和遞呈，靜息的T細胞由于獲得APC呈遞的抗原和危險信號的雙重刺激而活化，從而引起抗體產生、病損細胞及感染因子的清除等一系列免疫過程。綜上所述，因此，本領域迫切需要開發有效的Her2-neu陽性腫瘤治療性疫苗。
技術實現思路
本專利技術的一個目的就是提供一種新的具有熱休克蛋白和Herf-neu兩者生物活性的物質，它是熱休克蛋白和Her2-neu胞外區片段的融合蛋白。本專利技術的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞。本專利技術的另一目的是提供一種成本低廉和/或步驟簡便的生產所述Hsp70Ll-Her2-neu融合蛋白的方法。本專利技術的另一目的是提供用該融合蛋白制備Herf-neu陽性腫瘤治療性疫苗的方法。在本專利技術的第一方面，提供了一種融合蛋白，它包括(a)腫瘤抗原Her2_neu元件,該元件具有人腫瘤抗原Her2_neu的胞外區或其免疫原性片段的氨基酸序列；(b)熱休克蛋白元件，該元件具有人熱休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)任選的位于腫瘤抗原Her2_neu元件和熱休克蛋白元件之間的連接肽序列。在另一優選例中，所述的腫瘤抗原Her2_neu元件本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種融合蛋白，其特征在于，它包括：(a)腫瘤抗原Her2？neu元件，該元件具有人腫瘤抗原Her2？neu的胞外區或其免疫原性片段的氨基酸序列；(b)熱休克蛋白元件，該元件具有人熱休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)任選的位于腫瘤抗原Her2？neu元件和熱休克蛋白元件之間的連接肽序列。
【技術特征摘要】
1.一種融合蛋白，其特征在于，它包括 (a)腫瘤抗原Her2-neu元件,該元件具有人腫瘤抗原Her2_neu的胞外區或其免疫原性片段的氨基酸序列； (b)熱休克蛋白元件，該元件具有人熱休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及 (c)任選的位于腫瘤抗原Her2-neu元件和熱休克蛋白元件之間的連接肽序列。2.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述腫瘤抗原Her2-neu元件為含腫瘤抗原Her2-neu的342-456位的片段；和/或 所述的熱休克蛋白元件選自下組Hsp70或Hsp70Ll。3.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述的熱休克蛋白元件具有SEQIDNO 8所示的氨基酸序列,所述的腫瘤抗原Her2-neu元件具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。4.一種分離的DNA分子，其特征在于，它編碼權利要求I所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳艷峰，萬濤，曹雪濤，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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