本發明專利技術公開了一種鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物，具體是將病毒性肝炎病毒接種雞胚，收集尿囊液，并在單層鴨胚成纖維細胞中培養，獲得的鴨病毒性肝炎病毒含量≥107EID50/0.1mL，然后將此病毒液于蔗糖墊上，離心，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入皂苷QuilA和脂類混合物，進行透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物。本發明專利技術復合物免疫活性高，毒副作用小。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物及其制備方法，屬于獸用生物制品
技術介紹
鴨病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis,簡稱DVH)是雛鴨的ー種急性致死性傳染病。該病發生于孵化雛鴨的季節，一旦發生，在雛鴨群中傳播很快，發病率可達100%。其臨 床表現主要是角弓反張，病變主要為肝臟腫大并有出血斑點。本病最早發生于美國，其后在英國、加拿大、德國、意大利、印度等國陸續流行。我國自1958年在上海首次分離到鴨肝炎病毒DHV以來，相繼在全國許多省市流行發生，造成巨大的經濟損失，已成為影響養鴨業健康發展的重要威脅。鴨肝炎病毒有3個血清型，即I、II、III，DVH病毒I型屬于小RNA病毒科，呈球形或類球形，直徑在20-40NM，無囊膜，無血凝性，可在鴨、雞、鵝胚尿囊腔増殖。病毒抵抗力強，在自然環境中可較長時間存活，目前普遍存在的鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒I型引起的。DVH病毒II型屬于星狀病毒，DVH-III屬于小RNA病毒。DVH病毒三種血清型之間無交叉保護作用。鴨病毒性肝炎病毒與鴨こ型肝炎病毒無任何相關性。近年來鴨病毒性肝炎已在我國蔓延，嚴重阻礙了我國養鴨業的健康發展，出現了使用I型鴨病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黃抗體預防或治療無效的鴨群爆發疑似鴨肝炎的現象，懷疑為I型鴨肝炎變異株或新型鴨肝炎。用弱毒疫苗免疫雛鴨，受雛鴨本身免疫機能和母源抗體的影響，造成了鴨病毒性肝炎的局部暴發，給養殖業造成了巨大的損失。
技術實現思路
本專利技術的目的還在于提供ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物。本專利技術的目的還在于提供ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物的制備方法。為了實現以上目的，本專利技術鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物的制備步驟為以I型鴨病毒性肝炎制備為例，(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進行孵化至第5 7天，如果出現死亡、發育不良時，立刻進行尿囊液的收獲，置于_80°C冰箱進行保存；(2)培養病毒將步驟(I)中的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細胞，37°C培養，每隔10 12h觀察細胞，如果細胞病變達到80%時，收獲細胞，-20°C和室溫反復凍融3次,5000r/min離心20 40min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心I.5 2. 5h，病毒含量達到IO7EID5tlA). ImL吋，收集鴨病毒性肝炎病毒；(3)脂類混合物的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega- ο中，使溶解完全，稀釋至8 12mg/mL，分裝，2 8°C保存備用；(4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL, pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物的制備pH為7. 2的PBS緩沖液稀釋病毒液到蛋白濃度為10mg/mL，加入濃度為20%的mega-ΙΟ至其終濃度為2%，室溫作用2 3h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2 3h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入皂苷QuilA和脂類混合物，其中皂苷質量含量為O. I O. 2%,脂類混合物在復合物中的濃度為50 IOOuL/mL,將此溶液加入透析袋中進行48 54h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物。本專利技術復合物毒副作用小，免疫抗體效價高。具體實施例方式下面結合一些具體實施方式對本專利技術進ー步詳細介紹。 實施例I(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進行孵化至第5天時，觀察雞胚是否出現死亡或者發育不良或水腫。如果出現死亡或者發育不良和水腫時，立刻進行尿囊液的收獲。收集的尿囊液放在_80°C冰箱進行保存。如果第7天沒有出現觀察雞胚是否出現死亡或者發育不良則不能再收集,棄去全部雞胚；(2)培養病毒將準備好的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細胞，37°C培養，每隔12h進行觀察細胞，如果細胞病變達到80%時，收獲細胞，-20°C和室溫反復凍融3次,5000r/min離心30min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心2h,取少量樣品進行負染電鏡觀察。病毒含量達到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步實驗；(3)脂類混合物貯存液的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega-10中，使溶解完全,稀釋至終濃度為8mg/mL,分裝,8°C保存備用；(4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物的制備用pH為7. 2的PBS緩沖液將病毒液稀釋到蛋白濃度為10mg/mL，加入濃度為20的％mega-10至其終濃度為2%，室溫作用3h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入O. 1%量的皂苷QuilA和脂類混合物50uL/mL，將此溶液加入透析袋中進行48h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物。實施例2(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進行孵化至第6天時，觀察雞胚是否出現死亡或者發育不良或水腫。如果出現死亡或者發育不良和水腫時，立刻進行尿囊液的收獲。收集的尿囊液放在_80°C冰箱進行保存；(2)培養病毒將準備好的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細胞，37°C培養，每隔IOh進行觀察細胞，如果細胞病變達到80%時，收獲細胞，-20°C和室溫反復凍融3次,5000r/min離心40min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心I. 5h,取少量樣品進行負染電鏡觀察。病毒含量用。病毒含量達到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步實驗;(3)脂類混合物貯存液的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega-10中，使溶解完全,稀釋至終濃度為10mg/mL分裝,5°C保存備用；(4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物的制備用pH為7. 2的PBS緩沖液將病毒液稀釋到蛋白濃度為10mg/mL，加入20%mega-10至終濃度為2%，室溫作用2. 5h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 5%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2. 5h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入O. 2%量的皂苷QuilA和脂類混合物lOOuL/mL，將此溶液加入透析袋中進行50h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物。·實施例3(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進行孵化至第7天時，觀察雞胚是否出現死亡或者發育不良或水腫。如果出現死亡或者發育不良和水腫時，立刻進行尿囊本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物，其特征在于：該復合物由鴨病毒性肝炎病毒與皂苷QuilA、脂類混合物在蔗糖墊上制備而成。
【技術特征摘要】
1.ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物，其特征在于該復合物由鴨病毒性肝炎病毒與皂苷QuilA、脂類混合物在蔗糖墊上制備而成。2.如權利要求I所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物，其特征在于皂苷QuilA的質量含量為O. I O. 2%ο3.如權利要求I所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物，其特征在于脂類混合物由磷脂酰こ醇胺、膽固醇和濃度為20%的mega-ΙΟ混合而成。4.如權利要求3所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物，其特征在于脂類混合物的濃度為 50 100uL/mL。5.一種如權利要求I所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復合物的制備方法，其特征在于制備步驟包括 (O鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊 腔中増殖，放在孵化箱中進行孵化至第5 7天，如果出現死亡或者發育不良吋，立刻進行尿囊液的收獲，置于_80°C冰箱進行保存；如果雞胚超過第7天沒有出現死亡或者發育不良應立刻棄去雞胚； (2)培養病毒將步驟(I)中的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細胞，37°C培養，每隔10 12h觀察細胞，如果細胞病變達到80%時，收獲細胞，-20°C和室溫反復凍融3次,5000r/min離心20 40min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心I. 5 2.5h，獲得鴨...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳紅云，韓改會，徐進，
申請(專利權)人：鄭州后羿制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。