一種核酸分離方法及其應用技術

本發明專利技術提供了一種核酸的分離方法，具體來講是根據核酸分子在溶液中的電荷性質，使其在電場中得到選擇性分離的方法；進一步的，本發明專利技術提供了用于該方法的分離裝置、以及該方法及裝置在核酸分離中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物工程
，具體涉及一種核酸的分離方法、裝置及其應用，進一步的，本專利技術涉及在疫苗制品中去除宿主細胞核酸殘留及檢測殘留的宿主核酸含量的方法、裝置及其應用。
技術介紹
預防接種傳統上是針對傳染病綜合性預防的重要措施之一，疫苗的免疫效果和安全性備受關注。目前包括重組(CH0細胞)乙肝疫苗和VeiO細胞狂犬病疫苗在內的很多疫苗都是細胞培養疫苗，在疫苗的生產過程中不可避免地混入了宿主細胞核酸的污染。如果用混有宿主細胞核酸的蛋白疫苗免疫人體，將有可能產生不可預料的后果，可能造成受體基因的插入突變，導致抑癌基因失活后癌基因被激活等嚴重后果。 考慮到這些潛在的風險，國際以及各國的醫療衛生機構都對疫苗制品中DNA的殘留制定了相關標準。1986年世界衛生組織規定，用細胞系生產的疫苗每支DNA的殘留不能超過lOOpg，而在1997年美國藥品食品衛生監督局規定在美國使用的細胞系疫苗DNA殘留不能超過10pg，目前我國按照世衛組織的標準，規定每支疫苗的DNA殘留不能超過lOOpg。這些嚴格的質量標準使得去除疫苗中的DNA成為生產過程中的一個關鍵的技術瓶頸。制備病毒疫苗的傳統工藝是采用超濾濃縮、分子篩層析純化等手段進行純化，缺陷是制備的疫苗中宿主DNA的殘留量較高。為了克服這個缺陷，有的研究人員通過改變超濾濃縮的倍數和層析柱的連接方式，降低宿主DNA的殘留量。去除宿主細胞DNA殘留的另一種方法是采用DNA酶處理。歐洲專利0870508和美國專利5948410披露了這種類型的常規方法。其涉及兩步處理，首先用DNA酶(例如,Benzonase)處理,然后用陽離子洗漆劑(例如，CTAB)處理。盡管這些措施在一定程度上改善了疫苗制品的品質，但純化效率不高、技術穩定性較差，未能從根本上解決疫苗中的宿主DNA殘留的問題。為了嚴格控制疫苗生產及終產品中DNA的殘留，在疫苗生產的整個過程中要對DNA含量的變化進行全程監控，以便了解每個環節在DNA去除方面的能力。這就需要建立敏感而穩定的檢測技術，目前鑒定疫苗中DNA殘留量的方法主要有三種分子雜交法、基于DNA結合蛋白的方法，和實時熒光定量PCR法。分子雜交法檢測疫苗中的DNA殘留，是基于不同標記的DNA探針與固定在硝酸纖維素膜上的宿主細胞DNA之間的雜交，通過標記分子檢測與宿主細胞形成雜交的探針的量，進而推測宿主細胞DNA的含量。通常可以用不同的標記物對DNA探針進行標記，包括標記酶、生物素、放射性同位素、地高辛等。由于地高辛標記核酸探針的高靈敏度和操作上的便利，目前被廣泛使用，其檢測靈敏度可達IOpg以下。基于DNA結合蛋白的檢測方法是利用兩種能與DNA非特異性結合的蛋白質，單鏈DNA結合蛋白和抗單鏈DNA抗體。檢測的基本過程是，使生物素-DNA單鏈結合蛋白或尿素酶-抗ssDNA的單抗與被檢測的宿主細胞DNA結合，利用親合素將此復合物連接到生物素-硝酸纖維素膜，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2導致pH值發生變化，根據pH值的變化推算被結合的DNA的含量。熒光定量PCR是另一種廣泛使用的DNA檢測技術，利用PCR擴增原理，在加入一對擴增引物的同時加入一個特異性的熒光探針，產物的增加可以通過熒光信號指示，通過實時監控PCR體系中的熒光信號的變化，推測樣本中初始模板的定量。定量PCR可實時檢測產物量，通過加入已知濃度的標準樣品繪制標準曲線，然后根據待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度。雖然這三種檢測方法在實際工作中均得到了合理的應用，但不難看出這三種檢測方法均是對疫苗樣本中核酸成分的間接檢測，在穩定性、靈敏性以及使用的方便程度上還存在可優化空間。盡管存在這種可能性，低濃度核酸的定量檢測在技術上仍然是一個巨大的挑戰，目前還沒有成熟的能夠通用的解決方案，尤其是對疫苗中的DNA殘留這種無明顯序列特征的樣本的檢測。
技術實現思路
本專利技術涉及以下按順序編號的段落定義的主題I. 一種核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括至少兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；2)將包含待分離核酸的溶液加入到電泳槽中，3)施加外加電場,使溶液中的核酸分子選擇性地分布于一個被分隔的或被可操作性分隔的電泳區域，從而得到分離。2.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于用于固定分隔不同電泳區域的材料包括瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、帶孔或微孔的固相支持物。3.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于用于可操作性分隔不同電泳區域的方式包括閥門、開關、可阻斷性流道。4.根據段落1-3任一項所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。5.根據段落4所述的核酸分離方法，其特征在于所述選擇性擇性核酸分離部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。6.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集。7.根據段落6所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括槽體、陽極、陰極和電泳區域；電泳區域由固定分隔或可操作性分隔隔開的兩個區域組成，陽極和陰極分別位于這兩個區域中。8.根據段落6所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括槽體、陽極、陰極和電泳區域；電泳區域包括兩個獨立的區域，所述獨立的區域經電泳通道連接，電泳通道中帶有固定分隔或可操作性分隔；陽極和陰極分別位于這兩個區域內。9.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括三個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；陽極和陰極分別位于兩端的區域內。10.段落6或9所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。11.根據段落10所述的核酸分離方法，其特征在于所述選擇性擇性核酸分離部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。12.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括兩個固定分·隔的或可操作性分隔的電泳區域，分別為陽極區域和中間區域，陽極和陰極分別位于陽極區域和中間區域中；2)將核酸/蛋白溶液加入到電泳槽的中間區域中；3)施加外加電場，使溶液中的核酸成分選擇性地分布于陽極區域中，從而使其與主要分布于中間區域中的蛋白成分分離；4)分別收集分布于陽極區域的核酸成分和分布于中間區域的蛋白成分。13.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，分別為陽極區域和中間區域，陽極和陰極分別位于陽極區域和中間區域中，陽極區域和中間區域之間還包括選擇性核酸分離部件；2)將核酸/蛋白溶液加入到電泳槽的中間區域中；3)施加外加電場，使溶液中的核酸成分從中間區域向陽極區域泳動，在此過程中，被位于中間區域和陽極區域之間的能選擇性核酸分離部件所捕獲，從而使其與主要分布于中間區域中的蛋白成分分離；4)分別收集主要分布于中間區域的蛋白成分和被選擇性核酸分離部件所捕獲的核酸成分。1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟：1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括至少兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；2)將包含待分離核酸的溶液加入到電泳槽中，3)施加外加電場，使溶液中的核酸分子選擇性地分布于一個被分隔的或被可操作性分隔的電泳區域，從而得到分離。

【技術特征摘要】
1.一種核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括至少兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；2)將包含待分離核酸的溶液加入到電泳槽中，3)施加外加電場，使溶液中的核酸分子選擇性地分布于一個被分隔的或被可操作性分隔的電泳區域，從而得到分離。2.根據權利要求I所述的核酸分離方法，其特征在于用于固定分隔不同電泳區域的材料包括瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、帶孔或微孔的固相支持物。3.根據權利要求I所述的核酸分離方法，其特征在于用于可操作性分隔不同電泳區域的方式包括閥門、開關、可阻斷性流道。4.根據權利要求1-3任一項所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。5.根據權利要求4所述的核酸分離方法，其特征在于所述選擇性擇性核酸分離部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。6.根據權利要求I所述的核酸分離...

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜權，杜軍，
申請(專利權)人：杜權，杜軍，
類型：發明
國別省市：