一種卡特蘭組織培養(yǎng)的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種卡特蘭組織培養(yǎng)繁殖的方法，屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。以卡特蘭新梢為材料，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，進(jìn)行卡特蘭組培苗的快速擴(kuò)繁。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提高了培養(yǎng)基數(shù)，有效解決了卡特蘭莖尖常規(guī)培養(yǎng)方法的外植體褐變現(xiàn)象，擴(kuò)大了增殖系數(shù)，具有最高的誘導(dǎo)成活率；培養(yǎng)基配方在MS和KC基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良，易配制，成本低。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)的有益改進(jìn)，可為卡特蘭產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種卡特蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，屬于植物細(xì)胞工程
ニ
技術(shù)介紹
卡特蘭是世界上栽培最多，最受人們喜愛(ài)的洋蘭之一。它花型優(yōu)美，色彩艷麗，并且有特殊的芳香。一年四季都有不同的品種開(kāi)花。花期較長(zhǎng)，一般可開(kāi)放2 3周，不僅是珍貴的盆花，還是重要的高檔切花。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用大大促進(jìn)了卡特蘭的規(guī)模生產(chǎn)，不僅能加快新品種推廣，而且能夠獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。但是卡特蘭外植體在初始培養(yǎng)中易褐化死亡，是原球莖誘導(dǎo)成功的一大障礙。目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起，即培養(yǎng)材料變褐主要是由傷ロ處分泌的酚類(lèi)化合物引起。選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w是克服褐變的最主要的手段，取材時(shí)應(yīng)注意選擇分生能力較強(qiáng)的外植體。成年植株比幼苗褐變程·度嚴(yán)重，夏季材料比冬季、早春及秋季材料的褐變嚴(yán)重，冬季培養(yǎng)物的存活率明顯高于夏秋季節(jié)。因此，采芽時(shí)機(jī)應(yīng)盡可能避開(kāi)生長(zhǎng)旺盛期。對(duì)外植體要充分漂洗，促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)滲出。培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類(lèi)型，篩選適宜的培養(yǎng)基配方。在組織培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)常進(jìn)行細(xì)胞篩選，可以剔除易褐變的細(xì)胞。在外植體接種廣2天后立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5飛次，可基本解決外植體的褐變問(wèn)題。現(xiàn)有技術(shù)方案切取優(yōu)良母株的新梢進(jìn)行莖尖誘導(dǎo)繁育。通過(guò)研究，篩選出適合卡特蘭莖尖培養(yǎng)及分生苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方和組培快繁技木。新梢經(jīng)消毒后，于無(wú)菌條件下將外包嫩葉剝至廣2片，小心切除芽基部，保留生長(zhǎng)點(diǎn)內(nèi)長(zhǎng)約2 3cm的莖尖頂端分生組織塊，接入莖尖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，每瓶放I塊。將接種后的培養(yǎng)基置于室溫(25 ±2)で、相對(duì)濕度70°/Γ90%、光照強(qiáng)度20001χ條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，長(zhǎng)成合格分生苗。莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)以配方Α. 1/2 MS + BA 2 mg/L + NAA O. 2 mg/L + 椰乳200 ml/L + 3 %蔗糖和配方B. 1/2 MS + BA 2mg/L + NAA 0.2 mg/L + 3%蔗糖效果較好，表現(xiàn)為莖尖組織塊分生率較高，誘導(dǎo)培養(yǎng)40天后外植體基部分生出較多的愈傷組織和不定芽點(diǎn)，經(jīng)繼代培養(yǎng)，不定芽點(diǎn)逐漸發(fā)育長(zhǎng)成不定芽，切取的不定芽塊轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，60天后長(zhǎng)成根莖葉齊全、生長(zhǎng)正常的分生瓶苗，可出瓶移栽。現(xiàn)有技術(shù)從莖尖誘導(dǎo)不定芽到分生苗的培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可能與卡特蘭內(nèi)源激素的作用和植物體生長(zhǎng)發(fā)育周期較長(zhǎng)有夫。莖尖培養(yǎng)極易發(fā)生褐變，導(dǎo)致外植體切ロ組織壞死。需通過(guò)以下幾個(gè)方面的工作減輕外植體的褐變發(fā)生首先，要避免在高溫季節(jié)采芽，因?yàn)楦邷赜欣参矬w內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生，培養(yǎng)時(shí)褐變嚴(yán)重，新芽成活率較低，春秋季是較適宜的采芽季節(jié)；其次，需在培養(yǎng)基內(nèi)単獨(dú)或混合加入活性炭lg/L、聚こ烯吡咯烷酮(PVP)5g/L、檸檬酸2g/L等藥劑抑制褐變；再次，培養(yǎng)溫度要保持在20 25で，此時(shí)培養(yǎng)材料分泌產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)較少，室溫超過(guò)30°C時(shí)，褐變物質(zhì)顯著增加，成活率大大降低；此外，暗培養(yǎng)和勤轉(zhuǎn)瓶(15 20天轉(zhuǎn)I次)也能減輕褐化物質(zhì)對(duì)外植體的危害。三
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
技術(shù)問(wèn)題本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)切取卡特蘭新梢的頂芽和不同部位的側(cè)芽生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行液體培養(yǎng)，詳細(xì)描述了莖尖外植體的切割方法，一個(gè)新梢可以切取5個(gè)外植體，提高了増殖系數(shù)。其次通過(guò)適宜的激素配比和液體培養(yǎng)技術(shù)，有效解決卡特蘭莖尖常規(guī)培養(yǎng)方法的外植體褐變現(xiàn)象，提高培養(yǎng)質(zhì)量。因?yàn)槊复俸肿內(nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個(gè)條件，即酶、底物和氧。液體培養(yǎng)阻斷了外植體與氧氣的接觸，可有效抑制褐變現(xiàn)象，從而簡(jiǎn)化卡特蘭的莖尖培養(yǎng)流程。技術(shù)方案 利用卡特蘭新梢頂芽和側(cè)芽分生組織為外植體，通過(guò)添加適宜的激素配比和液體培養(yǎng)條件，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化，促進(jìn)愈傷組織增殖并分化出原球莖，切割原球莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)出幼苗，經(jīng)生根培養(yǎng)長(zhǎng)成合格的瓶苗。具體步驟如下 Cl)外植體的選擇與滅菌 選61厘米長(zhǎng)的新梢作外植體，用升汞消毒法進(jìn)行消毒，分別取新梢上頂芽和側(cè)芽作外植體進(jìn)行培養(yǎng)，切割頂芽和側(cè)芽生長(zhǎng)點(diǎn)中心部位的分生組織大小為直徑2 4mm。(2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 將外植體分生組織塊放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，卡特蘭莖尖増殖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的MS + 6-BA3 10mg/L + NAA0. 5 5mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培養(yǎng)條件為液體震蕩暗培養(yǎng)，溫度20 25°C，液體培養(yǎng)皿放置在回旋器上，回旋頻率120rpm，培養(yǎng)40 60天； 其中，改良的MS基本培養(yǎng)基為，單位mg/L NH4N03 :850 1850、KN03 :1000 1900、CaCl2 · 2H20 :250 650、MgS04 · 7H20 :200 400、KH2P04 50 200、KI :0. 4 O. 9、H3B03 :3. O 7. 0、MnS04 · 4H20 :12. O 25. 0、ZnS04 · 7H20 :2. 5 9. 5、Na2Mo04 · 2H20 O.16 O. 35、CuS04 · 5H20 :0. 016 O. 025、CoC12 · 6H20 :0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 :18. O 40. O、肌醇:50 100、氨基こ酸2. 0 3· O、谷氨酸10 18、天冬酰胺酸10 18 ； (3)繼代培養(yǎng) 把增殖的愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為改良的KC +瓊脂6000 8000mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培養(yǎng)條件為 溫度 20 28°C，光強(qiáng) 1500 3000Lx，每天光照12 16小時(shí)，每30天轉(zhuǎn)接I次，愈傷組織上逐漸分化出原球莖，原球莖進(jìn)ー步切割轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，發(fā)育成幼苗； 其中，改良的 KC 基本培養(yǎng)基為，單位mg/L Ca (N03) 2 · 4H20 :50(Tl000、ΚΗ2Ρ04 200 400、MgS04 · 7Η20 :100 300、(NH4) 2S04 :400 1000、NH4N03 :350 850、FeS04 · 7H20 :10 50、KCl :20(T400、MnS04 · 4H20 :3. O 10. O ; (4)生根培養(yǎng) 將3 4cm高的苗接入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為改良的KC + ΝΑΑ0. 2^2mg/L +瓊脂6000 8000mg/L +糖20000 30000mg/L。培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)，溫度為20 28°C，光強(qiáng)1500 3000Lx，每天光照16小時(shí)。幼苗長(zhǎng)成合格的瓶苗。有益效果 本專(zhuān)利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果 I、外植體選擇途徑有優(yōu)勢(shì)，即可以擴(kuò)大増殖系數(shù)，相比頂芽培養(yǎng)側(cè)芽分生力強(qiáng)，具有較高的培養(yǎng)成活率。2、液體培養(yǎng)可以克服卡特蘭莖尖培養(yǎng)極易發(fā)生褐變的障礙，提高培養(yǎng)質(zhì)量。3、培養(yǎng)基配方在MS和KC基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良，易配制，成本低。四附圖說(shuō)明 圖I新梢側(cè)芽誘導(dǎo)的愈傷組織 圖2愈傷組織分化的叢生苗 圖3卡特蘭幼苗 五具體實(shí)施例方式 I、切割卡特蘭新梢的頂芽和側(cè)芽作外植體培養(yǎng)材料。在毎年春秋兩季卡特蘭生長(zhǎng)旺盛期采集材料，選6 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
卡特蘭的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，（1）？外植體的選擇與滅菌選6~8厘米長(zhǎng)的新梢作材料，用升汞消毒法進(jìn)行消毒，切取頂芽和側(cè)芽生長(zhǎng)點(diǎn)中心部位的分生組織塊作外植體進(jìn)行培養(yǎng)；（2）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將外植體分生組織塊放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，卡特蘭莖尖增殖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良的MS？+？6？BA3～10mg/L？+？NAA0.5～3mg/L？+？糖20000～30000mg/L，培養(yǎng)條件為液體震蕩暗培養(yǎng)，溫度20～25℃，液體培養(yǎng)皿放置在回旋器上，回旋頻率120rpm，培養(yǎng)40？60天；其中，改良的MS基本培養(yǎng)基為，單位：mg/L：NH4NO3：850～1850、KNO3：1000～1900、CaCl2·2H2O：250～650、MgSO4·7H2O：200～400、KH2PO4：50～200、KI：0.4～0.9、H3BO3：3.0～7.0、MnSO4·4H2O：12.0～25.0、ZnSO4·7H2O：2.5～9.5、Na2MoO4·2H2O：0.16～0.35、CuSO4·5H2O：0.016～0.025、CoCl2·6H2O：0.016～0.025、FeSO4·7H2O：20.0～30.0、Na2·EDTA·2H2O：18.0～40.0、肌醇：50~100、氨基乙酸：2.0~3.0、谷氨酸：10~18、天冬酰胺酸：10~18；（3）繼代培養(yǎng)把增殖的愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為：改良的KC？+？瓊脂6000～8000mg/L？+？糖20000～30000mg/L，培養(yǎng)條件為：溫度20～28℃，光強(qiáng)1500～3000Lx，每天光照？12~16小時(shí)，每30天轉(zhuǎn)接1次，愈傷組織上逐漸分化出原球莖，原球莖進(jìn)一步發(fā)育成幼苗；其中，改良的KC基本培養(yǎng)基為，單位：mg/L：Ca(NO3)2·4H2O：500~1000、KH2PO4：200~400、MgSO4·7H2O：100～300、(NH4)2SO4：400～1000、NH4NO3：350～850、FeSO4·7H2O：10～50、KCl：200~400、MnSO4·4H2O：3.0～10.0；（4)？生根培養(yǎng)將3～4cm高的苗接入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：改良的KC？+？NAA0.2~2mg/L？+？瓊脂6000～8000mg/L？+？糖20000～30000mg/L，培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)，溫度為20～28℃，光強(qiáng)1500～3000Lx，每天光照16小時(shí)。...

【技術(shù)特征摘要】
1.卡特蘭的組織培養(yǎng)方法，其特征在干， (1)外植體的選擇與滅菌 選61厘米長(zhǎng)的新梢作材料，用升汞消毒法進(jìn)行消毒，切取頂芽和側(cè)芽生長(zhǎng)點(diǎn)中心部位的分生組織塊作外植體進(jìn)行培養(yǎng)； (2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 將外植體分生組織塊放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，卡特蘭莖尖増殖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的MS + 6-BA3 10mg/L + NAA0. 5 3mg/L + 糖 20000 30000mg/L，培養(yǎng)條件為液體震蕩暗培養(yǎng)，溫度20 25°C，液體培養(yǎng)皿放置在回旋器上，回旋頻率120rpm，培養(yǎng)40-60天； 其中，改良的MS基本培養(yǎng)基為，單位mg/L NH4N03 :850 1850、KN03 :1000 1900、CaCl2 · 2H20 :250 650、MgS04 · 7H20 :200 400、KH2P04 50 200、KI :0. 4 O. 9、H3B03 :3. O 7. 0、MnS04 · 4H20 :12. O 25. 0、ZnS04 · 7H20 :2. 5 9. 5、Na2Mo04 · 2H20 O. 16 O. 35、CuS04 · 5H20 :0. 016 O. 025、CoC12 · 6H20 :0. 016 O. 025、FeS04 · 7H20 20. O 30. O、Na2 · EDTA · 2H20 :18. O 40...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邵和平，張瓊，張寧寧，孫永平，夏明霞，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：