用于成像式熒光顯微術(shù)的顯微鏡及其使用方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于成像式熒光顯微術(shù)，特別是用于寬視野熒光顯微術(shù)的顯微鏡，其具有脈沖光源(1)和成像探測(cè)器(11)，其特征在于，設(shè)有用于門控制的裝置，并通過該門控制實(shí)現(xiàn)光源(1)和探測(cè)器(11)的同步，以達(dá)到反射光/散射光抑制的目的，從而將適宜于分析的熒光成分加以應(yīng)用，而將不適宜的成分進(jìn)行去除。此外本發(fā)明專利技術(shù)還涉及一種利用本發(fā)明專利技術(shù)的顯微鏡實(shí)施成像式熒光顯微術(shù)的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種用于成像式熒光顯微術(shù)，特別是用于寬視野熒光顯微術(shù)的顯微鏡，其具有脈沖式光源和成像探測(cè)器。此外，本專利技術(shù)還涉及一種特別是應(yīng)用本專利技術(shù)的顯微鏡的相應(yīng)方法。本專利技術(shù)總體涉及熒光顯微術(shù)，其中特別是涉及寬視野熒光顯微術(shù)。
技術(shù)介紹
寬視野熒光顯微術(shù)在生物和醫(yī)學(xué)研究中具有重大意義。在傳統(tǒng)的熒光顯微術(shù)中試樣或多或少經(jīng)逐點(diǎn)照射，而在所謂的寬視野顯微術(shù)(widefiled-microscopy)中所述試樣經(jīng)大面積照射，并用物鏡成像，以致該整個(gè)系統(tǒng)的PSF(點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，Point SpreadFunction)僅由物鏡的(探測(cè))PSF決定。與此相反，在共聚焦顯微鏡中入射光聚焦在試樣 上，以致該總PSF是照射PSF和探測(cè)PSF的乘積。較之在具有空間濾光片的共聚焦顯微鏡中通過探測(cè)針孔所能實(shí)現(xiàn)的，原則上，在寬視野熒光顯微鏡中有明顯更多的激發(fā)光從試樣反散射進(jìn)顯微鏡的探測(cè)器的光徑。然而為了能夠在令人滿意的條件下攝取圖像，必須充分抑制散射光/反射光。為此，在寬視野熒光顯微鏡中通常使用抑制該相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)的吸收濾光片。這通常借助于濾光立方體實(shí)現(xiàn)，所述濾光立方體除包含吸收濾光片(發(fā)射濾光片)外還包含用于激發(fā)光的光譜純化的激發(fā)濾光片和作為主分光片的二向色鏡，其中所述主分光片同時(shí)有助于激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片。但對(duì)此的缺點(diǎn)是，由于不變的濾光片特性，激發(fā)光的光譜調(diào)諧是不可能的。此外，在多波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，必需使用在合適的光譜位置上進(jìn)行透射或反射的完全特定的濾光片，這進(jìn)一步限制了濾光片的靈活性，并在許多可能的光譜激發(fā)范圍和探測(cè)范圍里需要進(jìn)行大量的濾光片組合，以至于這是不可能通過在實(shí)踐中常用的濾光片輪實(shí)現(xiàn)的。此外，各濾光片的光譜寬度還有所制約，即該探測(cè)范圍距激發(fā)波長(zhǎng)范圍必然有一定的光譜間距，從而在中間范圍損失了探測(cè)光，對(duì)于顯微鏡更高的靈敏度來說，該探測(cè)光是應(yīng)該可以探測(cè)到的。對(duì)共聚焦顯微鏡可示例性地參閱文獻(xiàn)DE 199 06 757 Al。其中該探測(cè)光通常至少部分作為被校準(zhǔn)的光束而穿過針孔。相應(yīng)地可使用聲光部件。與此相反，在寬視野顯微鏡中，在視野鏡組中存在真實(shí)圖像，這表明光在許多可能的空間角度中同時(shí)入射，這使得相應(yīng)的聲光部件的使用似乎反而沒什么意義，甚至完全不可能。這歸因于所述聲光部件需要極大的光孔，因此會(huì)特別復(fù)雜且昂貴。在文獻(xiàn)US 5252834中公開了顯微鏡中的門控制,但不用于成像和完全不適用成像中的反射光抑制/散射光抑制。但其中涉及逐點(diǎn)光譜攝像試樣的化學(xué)組成的特性測(cè)定(顯微分光光度術(shù))。其中未提供成像探測(cè)器。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于，在適用于寬視野熒光顯微術(shù)的成像式熒光顯微鏡中，利用簡(jiǎn)單的裝置實(shí)現(xiàn)反射光抑制/散射光抑制，用以因此在令人滿意的條件下攝取可再現(xiàn)的圖像。對(duì)此所需的措施應(yīng)可用簡(jiǎn)單的裝置成本低廉地實(shí)現(xiàn)。上述關(guān)于本專利技術(shù)的顯微鏡的目的是通過權(quán)利要求I的特征部分實(shí)現(xiàn)的。上述關(guān)于本專利技術(shù)的方法的目的是通過從屬權(quán)利要求18的特征部分實(shí)現(xiàn)的，更確切地說是利用本專利技術(shù)的顯微鏡。關(guān)于本專利技術(shù)的顯微鏡，其基本目的是如此實(shí)現(xiàn)的，即設(shè)有用于門控制的裝置，并通過該門控制實(shí)現(xiàn)光源和探測(cè)器的同步以達(dá)到反射光抑制/散射光抑制的目的，從而對(duì)適宜于處理的熒光成分加以利用，而對(duì)不適宜的成分予以舍棄。本專利技術(shù)的方法是相應(yīng)地為此設(shè)計(jì)的。本專利技術(shù)的方法提出對(duì)顯微鏡中的成像探測(cè)器結(jié)合脈沖光源進(jìn)行門控制。然而目前在顯微術(shù)中主要使用的照相機(jī)不允許進(jìn)行門控制，甚至不對(duì)所有像素同時(shí)進(jìn)行，因?yàn)橥ǔＪ峭ㄟ^共同的讀取寄存器進(jìn)行按序讀取。通常也不允許使用具有單光子靈敏度的CMOS芯片，因?yàn)楸M管可以利用其進(jìn)行并行讀取，但該讀取過程在亞IOOns范圍內(nèi)對(duì)適用的門控制 來說實(shí)在是太慢了。基于本專利技術(shù)，優(yōu)選將以蓋革模式運(yùn)行的雪崩光電二極管的陣列(APD陣列；其中這種APD有時(shí)也被稱為“硅光電倍增管”)用于成像設(shè)備，所述成像設(shè)備允許進(jìn)行門控制的，并可借助它實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的反射光抑制/散射光抑制。原則上也可以考慮其它適于“可門控制的照相機(jī)”的可能性。本專利技術(shù)基于利用脈沖光源和成像探測(cè)器進(jìn)行工作的熒光顯微鏡。考慮到熒光的衰變時(shí)間，當(dāng)脈沖光源所具有的脈沖寬度在熒光團(tuán)的壽命范圍內(nèi)或更好地低于此范圍時(shí)，對(duì)于脈沖光源是有利的。基于通常的熒光染料，脈沖寬度在5ns范圍內(nèi)，優(yōu)選在Ins范圍內(nèi)，更優(yōu)選在200ps范圍內(nèi)是有利的。光源可以是激光器、LED、閃光LED或可被激發(fā)激光的放大介質(zhì)等。如果該光源可觸發(fā)則更是特別有利的，其中這一點(diǎn)對(duì)于本專利技術(shù)技術(shù)方案的實(shí)施不是必不可少的。在特別有利的方式中，可應(yīng)用脈沖式白光激光器、脈沖式LED、脈沖式OPO和其它脈沖式激光器。使用可門控制的成像探測(cè)器，換言之“可門控制的照相機(jī)”進(jìn)行探測(cè)。其可以是預(yù)接具有經(jīng)某種改制的可觸發(fā)的/可門控制的光學(xué)快速快門的照相機(jī)，或是可門控制地激活/去活的成像探測(cè)器。也可利用在產(chǎn)生探測(cè)信號(hào)后提供相應(yīng)信息的成像探測(cè)器，該信息表明是否應(yīng)處理或棄去相應(yīng)的信號(hào)成分。可門控制的光學(xué)快門可以是例如可快速控制的光學(xué)圖像放大器，所述圖像放大器在關(guān)閉狀態(tài)下不增強(qiáng)光，而在接通狀態(tài)下增強(qiáng)光；也可以是可飽和的光學(xué)吸收器，所述光學(xué)吸收器通過短的光脈沖而飽和，并由此在施加門控制時(shí)變成透明的。可門控制的探測(cè)器可基于以蓋革模式運(yùn)行的雪崩光電二極管(APD)中的陣列實(shí)現(xiàn)。為此，該成像探測(cè)器的每個(gè)單個(gè)像素均由單個(gè)以蓋革模式運(yùn)行的APD陣列組成或由其中多個(gè)陣列組成(=子陣)。通過施加合適的門電壓開啟單個(gè)APD的蓋革模式，由此實(shí)現(xiàn)入射光子能夠觸發(fā)對(duì)APD的擊穿，并產(chǎn)生相應(yīng)的電子信號(hào)。只要門控制關(guān)閉，該狀態(tài)就不會(huì)發(fā)生，以致此時(shí)該探測(cè)器是去活的。也可考慮門控制的其它實(shí)現(xiàn)可能方式，例如與此相反的，所述探測(cè)器的輸出端在門控制的斷開時(shí)間中短路或針對(duì)信號(hào)支路中斷。類似的可由外部控制的門控制也可在其它的照相機(jī)類型如CMOS芯片或CXD芯片中實(shí)現(xiàn)。原則上不一定需要在門控制斷開狀態(tài)下抑制信號(hào)的產(chǎn)生。“保存”相應(yīng)的時(shí)間信息就足夠了。在極端情況下，對(duì)每個(gè)單個(gè)光子賦以時(shí)間標(biāo)記，即對(duì)每個(gè)單個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間予以存儲(chǔ)就足夠了，用以在下游的數(shù)據(jù)處理設(shè)備(現(xiàn)場(chǎng)可編程序門列陣(FPGA)、數(shù)字信號(hào)處理設(shè)備(DSP)及其他)中判定是否應(yīng)處理該光子或舍棄該光子。這并不是對(duì)每個(gè)單個(gè)光子所必須進(jìn)行的。原則上對(duì)每個(gè)像素錄下時(shí)間信號(hào)分布或其一部分，并隨后加以處理就足夠了。前述所討論的技術(shù)之間的轉(zhuǎn)換方式不是一成不變的，特別是由于當(dāng)今日益增強(qiáng)的集成電子技術(shù)。重要的是，該成像設(shè)備是可門控制的，其中對(duì)所有像素優(yōu)選存在一致的(同時(shí)的)門控制，盡管在特定情況下，也可考慮不同的時(shí)間門位置(temporal gatepositions)。富于獨(dú)創(chuàng)性的關(guān)鍵的一步在于，該可門控制的成像設(shè)備與脈沖光源是同步的，從而在處理中可再現(xiàn)性地利用適宜的熒光成分，而舍棄不適宜的成分。優(yōu)選將屬于目標(biāo)熒光 的光成分通過適宜的門控制用于成像，也就是說，如所實(shí)現(xiàn)的那樣彼此相互獨(dú)立。屬于反射光或散射光的成分被舍棄。在某些情況下有意義的是，在照射后對(duì)可自由調(diào)節(jié)的時(shí)間范圍內(nèi)的熒光加以使用，而舍棄其它的光，或者將其歸入或輸入至少一個(gè)其它的探測(cè)通道。這對(duì)試樣來說是至關(guān)重要的，對(duì)試樣來說能夠通過熒光壽命推測(cè)試樣內(nèi)部的局部情況。為應(yīng)用本專利技術(shù)的設(shè)想，該成像探測(cè)器即“照相機(jī)”僅需將其門控制與光源有效地同步。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于成像式熒光顯微術(shù)，特別是用于寬視野熒光顯微術(shù)的顯微鏡，其具有脈沖式光源(1)和成像探測(cè)器(11)，其特征在于，設(shè)有用于門控制的裝置，并通過該門控制實(shí)現(xiàn)光源(1)和探測(cè)器(11)的同步來達(dá)到反射光抑制/散射光抑制的目的，從而對(duì)適宜于處理的熒光成分加以利用，而對(duì)不適宜的成分進(jìn)行舍棄。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：V·塞弗里德，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：