制造人源化的非人類哺乳動物的方法技術

在此提供了在一種非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系的方法，包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內。在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類血細胞譜系的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系。還提供了在一種非人類哺乳動物體內生產出針對一種免疫原的人類抗體的多種方法、分泌這些單克隆抗體的雜交瘤以及由這些B細胞生產的抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體)以及由這些方法生產的非人類哺乳動物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】制造人源化的非人類晡乳動物的方法相關申請本申請要求于2009年6月29日提交的美國臨時申請號61/221，438的權益。通過引用將以上一項或多項申請的全部傳授內容結合在此。
技術介紹
對于以合成的和控制的方式在小型動物模型中研究針對病原體感染的人類免疫應答存在巨大的需求。過去二十年來，已經投入了巨大的努力用人血譜系細胞重新構建缺少T淋巴細胞和B淋巴細胞的重癥聯合免疫缺陷(SCid)型小鼠(Shultz LD7Ishikawa F，Greiner DL(2007)Nat RevImmunol 7:118-130)。然而，由于在受體小鼠體內移入較差、人類T細胞和B細胞快速消失、或造血細胞惡性腫瘤的快速發展，早期的嘗試是不成功的。通過使用不僅缺乏T細胞和B細胞(由于scid突變亦或重組活化基因(Rag)突變)而且缺乏自然殺傷(NK)細胞(由于缺失共同的Y鏈(Yc或I12rg))的受體小鼠實現了突 破(Hiramatsu H，et al. (2003) Blood 102 :873-880 ；Traggiai E，et al. (2004) Science304 :104-107) ο將人類造血干細胞(HSC)過繼性轉移到N0D_scid I12rg+(NSG)受體亦或BALB/c-Rag2^I12rg^受體體內導致HSC在受體骨髓(BM)中穩定地、長期地移入并且在外周(人源化小鼠或humice)體內產生全人血譜系細胞(Hiramatsu H, et al. (2003)Blood102 :873-880 ;Traggiai E, et al. (2004)Science 304 :104-107)。現存的人源化小鼠模型提供了用于研究人類病原體感染的一種重要工具(DavisPH, Stanley SL, Jr. (2003)Cell Microbiol 5 :849-860 ；Bente DA, et al. (2005)J Virol79 :13797-13799 ；Islas-Ohlmayer M，et al. (2004) J Virol 78 :13891-13900 ；GuiradoE, et al. (2006)Microbes Infect 8 1252-1259 ；Kneteman NM, et al. (2006) Hepatology43 :1346-1353 Jiang Q, et al. (2008) Blood 112 :2858-2868)(尤其是感染人血譜系細胞的那些)。它們也開始允許在小型動物模型中研究針對病原體的人類免疫應答。然而，目前可用的模型遠不是最佳的。例如，在不同的細胞譜系之間人類細胞重建的水平是顯著不同的。B細胞的重建是強勁的并且T細胞的重建是適當的，但是這些B細胞和T細胞都是無功能的。此外，NK細胞和髓系細胞的重建通常是較差的或不可檢出的。因此，對于人類免疫系統的改進的非人類模型以及制造它們的方法存在巨大的需求。專利技術概述在此所示的是，人類血細胞譜系被人類造血干細胞(HSC)的較差重建的主要是由于在該非人類哺乳動物體內缺乏對于這些細胞譜系的發育和維持所必需的適當的人類細胞因子。當將編碼人IL-15和Flt-3/Flk-2配體的質粒DNA遞送到人源化小鼠體內時(例如通過流體動力學尾靜脈注射)，人類細胞因子的表達持續2至3周，并且誘導出高水平的NK細胞持續一個月以上。細胞因子誘導的NK細胞表達活化和抑制受體兩者，在體外殺死靶細胞，并且在體內對病毒性感染強烈地應答。類似地，人類GM-CSF和IL-4、巨噬細胞集落刺激因子、或促紅細胞生成素以及IL-3的表達對應地導致樹突狀細胞、單核細胞/巨噬細胞、或紅細胞的重建顯著地增強(參見Chen, Q.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 106 21783-21788 (2009))，通過引用將其結合在此。而且，GM-CSF和IL-4增強了人類T細胞以及人類B細胞的重建。因此，使用人類細胞因子基因表達(例如通過流體動力學遞送)連同人類HSC—起是用于改善人源化小鼠體內特異性人類血細胞譜系的重建的一種簡單且有效的方法，這為在小型動物模型體內針對人類疾病以及它們的進展進行建模以及為針對人類免疫應答進行研究提供了一種重要的工具。因此，在此提供了在非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系的方法，由此制造出一種人源化的非人類哺乳動物。在具體實施方案中，制造出多種人源化小鼠(humice)。一方面，本專利技術是針對在一種非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系的方法，該方法包括將多種人類造血干細胞(HSC)以及編碼一種或多種人類細胞因子的一種(一種或多種)核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內。在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類血細胞譜系的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系。在另一方面，本專利技術是針對在一種非人類哺乳動物體內重建功能性人類NK細胞的方法，該方法包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當在該非人類哺乳動物體內表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類NK細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成功能性人類NK細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此增強了在該非人類哺乳動物體內這些人類NK細胞的重建。在又另一方面，本專利技術是針對在一種非人類哺乳動物體內重建功能性人類樹突狀細胞的方法，該方法包括將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當在該非人類哺乳動物體內表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此增強了在該非人類哺乳動物體內這些功能性人類樹突狀細胞的重建。在另一方面，本專利技術是針對在一種非人類哺乳動物體內重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當在該非人類哺乳動物體內表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類單核細胞/巨噬細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類單核細胞/巨噬細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞。在另一方面，本專利技術是針對在一種非人類哺乳動物體內重建功能性人類紅細胞的方法，該方法包括將人類HSC和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當在該非人類哺乳動物體內表達時這些人類細胞因子促進這些人類HSC分化成功能性人類紅細胞。在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類紅細胞的條件下維持該非人類哺乳動物，由此在該非人類哺乳動物體內重建功能性人類紅細胞。在另一方面，本專利技術是針對在一種非人類哺乳動物體內重本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.06.29 US 61/221,4381.一種在非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入到一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類血細胞譜系的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此在該非人類哺乳動物體內重建功能性人類血細胞譜系。2.如權利要求I所述的方法，其中在將HSC引入該非人類哺乳動物體內之后引入編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸。3.如權利要求I所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以裸DNA的形式或在一種載體中引入。4.如權利要求3所述的方法,其中該載體是一種質粒、一種病毒載體、或它們的一種組口 ο5.如權利要求4所述的方法,其中該病毒載體是一種慢病毒或一種腺病毒載體。6.如權利要求I所述的方法，其中編碼該一種或多種人類細胞因子的核酸以質粒DNA的形式使用流體動力學注射方法引入。7.如權利要求I所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是選自下組，該組由以下各項組成白細胞介素_12(IL-12)、白細胞介素-15(IL-15)、Flt3L(Fms-相關酪氨酸激酶3配體)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-3 (IL-3)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)以及它們的一種組入口 ο8.如權利要求I所述的方法，其中該非人類哺乳動物是一個小鼠。9.如權利要求8所述的方法，其中該小鼠是選自下組，該組由以下各項組成一種攜帶重度聯合免疫缺陷突變的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一種攜帶重度聯合免疫缺陷突變并且缺少針對細胞因子受體Y鏈的一種基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scidIL2R Y + 小鼠)以及一種 Balb/c rag+ y c+ 小鼠。10.如權利要求I所述的方法，其中被重建的該功能性人類血細胞譜系是功能性人類髓樣細胞、功能性人類淋巴樣細胞或它們的組合。11.如權利要求10所述的方法，其中這些人類髓樣細胞是人類單核細胞、人類巨噬細胞、人類樹突狀細胞、人類紅細胞、以及它們的組合；并且該人類淋巴樣細胞是人類NK細胞、人類B細胞、人類T細胞、以及它們的組合。12.如權利要求I所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是白細胞介素-15(IL-15)以及Fms-相關酪氨酸激酶3配體(Flt3L)，并且在該非人類哺乳動物體內重建的這些功能性血細胞譜系是人類NK細胞。13.如權利要求I所述的方法，其中該一種或多種人類細胞因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白細胞介素4 (IL-4)，并且在該非人類哺乳動物體內重建的這些功能性血細胞譜系是人類樹突狀細胞。14.如權利要求I所述的方法，其中該一種或多種細胞因子是巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)，并且在該非人類哺乳動物體內重建的這些功能性血細胞譜系是人類單核細胞/巨噬細胞。15.如權利要求I所述的方法，其中該一種或多種細胞因子是促紅細胞生成素(EPO)以及白細胞介素3 (IL-3)，并且在該非人類哺乳動物體內重建的這些功能性血細胞譜系是人類紅細胞。16.一種在非人類哺乳動物體內重建功能性人類NK細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當表達于該非人類哺乳動物體內時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類NK細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類NK細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內人類NK細胞的重建。17.如權利要求16所述的方法，其中該核酸編碼人類IL-15以及人類Flt-3/Flk-2配體。18.如權利要求17所述的方法，其中該非人類哺乳動物的外周血中約5%至約21%的白細胞是人類NK細胞。19.如權利要求18所述的方法，其中在該非人類哺乳動物體內將人類NK細胞的表達維持約30天。20.一種在非人類哺乳動物體內重建功能性人類樹突狀細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當表達于該非人類哺乳動物體內時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類樹突狀細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類樹突狀細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內功能性人類樹突狀細胞的重建。21.如權利要求20所述的方法，其中該核酸編碼人類GM-CSF以及人類IL-4。22.如權利要求21所述的方法，其中進一步包括引入編碼人類Flt-3/Flk-2配體的核酸。23.一種在非人類哺乳動物體內重建功能性人類單核細胞/巨噬細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當表達于該非人類哺乳動物體內時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類單核細胞/巨噬細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類單核細胞/巨噬細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內功能性人類單核細胞/巨噬細胞的重建。24.如權利要求23所述的方法，其中該核酸編碼人類巨噬細胞集落刺激因子。25.—種在非人類哺乳動物體內重建功能性人類紅細胞的方法，包括 a)將人類造血干細胞(HSC)和編碼一種或多種人類細胞因子的核酸引入一種免疫缺陷型非人類哺乳動物體內，其中當表達于該非人類哺乳動物體內時，這些人類細胞因子促進人類HSC分化成功能性人類紅細胞；并且 b)在其中在該非人類哺乳動物體內該核酸被表達并且這些人類HSC分化成多種功能性人類紅細胞的條件下維持該非人類哺乳動物， 由此增強了該非人類哺乳動物體內功能性人類紅細胞的重建。26.如權利要求25所述的方法，其中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳清風，陳建竹，
申請(專利權)人：麻省理工學院，
類型：發明
國別省市：