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    堿性磷酸酶標記信號放大系統技術方案

    技術編號:7841277 閱讀:321 留言:0更新日期:2012-10-12 20:38
    本發明專利技術公開一種堿性磷酸酶標記信號放大系統,以烷烴,烯烴或炔烴醇磷酸酯為底物,在堿性磷酸酶作用下產生游離的磷酸及相應的醇化合物,醇化合物在氧氣的參與下經醇類氧化酶作用生產醛或酮化合物及過氧化氫(H2O2),生成的醛和酮化合物在NADH存在下經醇類脫氫酶作用還原成醇化合物,生成的醇化合物繼續參與循環反應。循環生成的大量H2O2配合不同底物經過氧化物酶催化后可通過比色法、電化學法、化學發光法或熒光法進行檢測。因此,本系統可靈敏的對單獨的堿性磷酸酶或與抗原,半抗原,抗體,蛋白質,核酸及寡聚核苷酸相連接的堿性磷酸酶進行檢測,起到放大信號作用。所述的底物結構式如下:

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及一種超靈敏的信號倍增系統,具體地說,涉及一種新的堿性磷酸酶標記信號放大系統。
    技術介紹
    酶作為靈敏的標記物已被廣泛用于各種生化檢測系統,如免疫測定(ELISA),核酸測定(PCR和基因測序)等,其酶活力大小可用在一定條件下催化某一化學反應的速度來表示,催化反應速度愈大,活力愈高,反之則活力愈低,因此,測定酶活力實際就是測定酶促反應的速度。酶促反應速度常用單位時間內、單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示,單獨一個酶分子可以催化大量底物(如一分子高純度酶在Imin內可催化10000-1000000分子的底物),因而通過對產物生成及底物或共反應物消耗來反應的酶活力,檢測的不是酶本身,而是大量生成的底物或消耗的產物,從而提供了高度放大的信號。目前利用工具酶結合其他分析檢測手段的信號放大技術因其具有特異、靈敏、簡便、快速等特點,已在生物醫學研究領域及臨床疾病的診療中得到廣泛應用。相較于放射免疫(RIA)技術,酶聯技術具有試劑半衰期長,對環境污染小,試驗廢物易于處理等優點,但其測定敏感性仍比不上RIA技術,在一些方面尤其在微量物質測定方面還不能替代RIA。但由于放射性物質對人體、環境有極大危害,并且其操作和處理極為不便,因此,如何提高酶聯技術的測試靈敏度,使其達到甚至超越RIA技術,一直是科研界的研究熱點。酶循環法是在原始標記酶催化基礎上附加了一個反應系統(如酶底物反應循環或酶級聯反應),利用酶的底物特異性來放大靶物質(被測物)的測定方法。傳統的酶反應只能按靶物質的量生成相應的產物量,而酶循環法則可在一定的反應時間內通過靶物質的重復反應來增加產物的量。因此,通過延長反應時間和/或增加酶的用量可加速循環,增加循環次數,從而提高檢測靈敏度。這種由數個催化反應耦聯而構建的放大系統,是酶循環法標記技術放大的根本之所在,其敏感性的提高來源于真正的信號放大,而不是簡單地將一個分子轉變為更多的易于測定的分子,并且酶循環法僅循環靶物質,減少了樣品中存在的其它物質對測定的干擾,因此不需要對樣品進行預處理或對靶物質進行提取,是一種臨床應用前景十分廣闊的測定技術。單分子檢測一直是科學家長期以來夢寐以求的一項富有挑戰性的前沿領域,其技術的實現可使檢測靈敏度達到極限,在低含量物質檢測中更是具有里程碑的意義。酶循環法通過偶聯數個催化反應,可使單一底物通過循環反應生成大量的產物,從而實現高度的信號放大。因此,將酶循環法運用至酶標技術中,可實現酶標技術質的飛躍,大大的提高其檢測靈敏度,實現對微量甚至是痕量物質的檢測,進一步可以替代RIA法,實現技術更替。自1971年Engvall等學者創立了酶免疫分析技術以來,至今已有二十多種酶被應用于此項技術,其中堿性磷酸酶因具有高活性、高敏感性,在室溫下穩定,反應產物易于顯現,能商品化生產,染色背景低等優點,應用日益廣泛,尤其在免疫檢測、核酸測定等方面。
    技術實現思路
    本專利技術針對現有酶聯技術靈敏度低的不足,提供了一種通過循環酶法放大堿性磷酸酶標記信號的系統即堿性磷酸酶標記信號放大系統。為了解決上述技術問題,本專利技術采用的技術方案為一種堿性磷酸酶標記信號放大系統,包括( I) 一種堿性磷酸酶底物,其結構通式如下式(I)所示本文檔來自技高網
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    【技術保護點】

    【技術特征摘要】
    1.一種堿性磷酸酶標記信號放大系統,其特征在于該系統包括 (1)堿性磷酸酶底物,其結構通式如下式(I)所示2.根據權利要求I所述的堿性磷酸酶標記信號放大系統,其特征在于式(I)中所述的烷基,烯烴基和炔烴基為Cl-IO的烷基、C2-10的烯烴基或炔烴基;或Cl-IO的烷基、C2-10的烯烴基或炔烴基的取代基。3.根據權利要求2所述的堿性磷酸酶標記信號放大系統,其特征在于所述的Cl-IO的烷基、C2-10的烯烴基或炔烴基的取代基包括鹵代,=0,=N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2,SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, C00R, CONR2, 00CR, COR 和 NO2,其中每個R可以是H,C1-C8烷基,C2-C8雜烷,C3-C8環烷,C4-C10雜環烷,C1-C8?;?,C2-C8雜?;?,C2-C8烯,C2-C8雜鹵代烯烴,C2-C8炔,C2-C8雜炔或C5-C10雜環;其中R也可被鹵代,=0,=N-CN, =N-0R’,=NR,,OR,,NR,2,SR,,SO2R,,SO2NRj 2,NR,SO2R,,NR,C0NR,2,NR,COOR,,NR,COR,,CN, C00R,,C0NR,2, 00CR,,COR,和 NO2 取代,其中每個 R’ 可以是 H,C1-C8 烷基,C2-C8雜烷,C3-C8環烷,C4-C10雜環烷,C1-C8?;?,C2-C8雜?;?,C2-C8烯,C2-C8雜鹵代烯烴,C2-C8炔,C2-C8雜炔或C5-C10雜環取代,每個取代又可被適宜的取代基取代;如果取代基R或R'在相同或相鄰的原子上,兩者可形成5-8碳的環狀化合物,并且環上可以包含一個雜原子。4.根據權利要求I所述的堿性磷酸酶標記信號放大系統,其特征在于,所述的堿性磷酸酶標記信號放大組合物,包括了堿性磷酸酶底物,具體還包括以下幾項 (1)醇類氧化酶,能分別將堿性磷酸酶水解堿性磷酸酶底物生成的伯醇或叔醇氧化成相應的醛或酮化合物; (2)醇類脫氫酶,能將生成的醛和酮化合物轉化為醇化合物; (3)參與還原反應的共反應物——NADH,其與醇類脫氫酶共同作用能將生成的醛和酮化物轉化為醇化物; (4)用于檢測副產物H2O2的試劑。5.根據權利要求4所述的堿性磷酸酶標記信號放大...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:鄒炳德,鄒繼華,沃燕波,袁藝天,
    申請(專利權)人:寧波美康生物科技股份有限公司
    類型:發明
    國別省市:

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