本發明專利技術公開了水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，還公開了水稻葉綠體硫氧還蛋白OsTrx8基因的重組表達載體及其重組表達載體的制備方法，其制備方法簡單，為研究水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8在水稻中的功能提供了有力的工具。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程領域，特別涉及水稻葉綠體硫氧還蛋白基因還涉及該基因的重組表達載體和制備方法。
技術介紹
硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)廣泛地存在于生物界中，是一種低分子量 (12KD)、有還原雙硫鍵活力的蛋白質。硫氧還蛋白都含有高度保守的活性位點，其保守的活性位點為Trp-Cys-Gly-Pro-Cys,保守活性位點中存在兩個還原性的Cys殘基。在還原態， 硫氧還蛋白具有促使目標蛋白中_■硫鍵打開的作用。植物體中的硫氧還蛋白最初是在葉綠體中發現的，被認為是光合作用中一些關鍵酶的活化調節蛋白，后來在細胞質和線粒體中也發現了硫氧還蛋白，它們在結構和功能上都有所差異。并且植物中包含很多硫氧還蛋白異構體，并將這些異構體分為不同的亞型，如h型、f■型、m型、c型等。其中，h型硫氧還蛋白被NADPH和NADPH-硫氧還蛋白還原酶所還原；f型和m型為葉綠體硫氧還蛋白，被鐵氧還蛋白依賴的系統所還原。葉綠體硫氧還蛋白主要調節光依賴酶，在光照條件下，硫氧還蛋白催化目標蛋白二硫鍵的打開并激活目標蛋白；在黑暗條件下，硫氧還蛋白處于氧化態不具有活性。經研究發現，水稻基因組中至少含有30個編碼硫氧還蛋白的基因，按其在染色體上的順序統一命名為OsTrxf 30，分為5個亞群分別為m型，h型，x型，f型和pdil型。 有報道稱水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrX23，是一種冷脅迫誘導的蛋白，在體外對絲裂原活化蛋白激酶3 (0sMPK3)和絲裂原活化蛋白激酶6 (0sMPK6)具有負調控。水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx29是一種m型葉綠體硫氧還蛋白，利用RNAi抑制0sTrx29基因表達后，導致葉綠體發育異常，植株生長延遲。水稻葉綠體硫氧還蛋白0sTrx8屬于m型硫氧還蛋白，但其相關功能迄今為止尚未見報道。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的之一在于提供水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的核苷酸序列；目的之二在于提供所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體，目的之三在于提供水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的重組表達載體的制備方法，為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS在水稻中的功能研究提供了有力的工具。I、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因( Ti-xS,所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8 的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。2、含有所述水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體。進一步，所述重組表達載體為重組干擾表達載體flsT^^-RNAi，所述干擾重組表達載體是在pENTR/D-TOPO載體的克隆位點中插入水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrx8, U IOVO-OsTrxS載體，再將所得TOPO-GsT^rS載體與pANDA載體同源重組而得。3、所述重組表達載體的制備方法，具體步驟如下從水稻中克隆水稻葉綠體硫氧CN 102533810 A還蛋白基因0sTrx8并連接pENTR/D-T0P0載體，得TOPO-GsT^rS載體，將所得TOPO-GsT^rS 載體與pANDA載體進行同源重組，得重組干擾表達載體ttsT^^-RNAi。本專利技術的有益效果在于本專利技術提供了一個水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS, 為研究水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的功能奠定了基礎，還構建了含有水稻葉綠體硫氧還蛋白基因的重組表達載體，并且該載體為干擾重組表達載體，在植物細胞中能夠干擾水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的表達，因此可以通過水稻葉綠體硫氧還蛋白基因功能缺失觀察水稻表型的變化，從而得到水稻葉綠體硫氧還蛋白基因基因在水稻中的功能；還公開了水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS的重組表達載體的制備方法，其制備方法簡單，為研究0sTrx8基因在水稻中的功能提供了有力的工具。附圖說明為了使本專利技術的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本專利技術作進一步的詳細描述，其中圖I為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8電泳圖2為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的時空差異表達圖。具體實施例方式以下將參照附圖，對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優選實施例中使用的材料使用的水稻品種為水稻日本晴(Oryza Sativa L)由重慶市農業科學研究院提供；M-MLV逆轉錄酶、高保真DNA聚合酶pfu、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、PMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、入-Hind III DNA Marker 及 DL2 000 DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技(北京)有限公司；氨節青霉素(Ampici 11 in, Amp)和卡拉霉素 (Kanamycin, Kan)為Sigma公司產品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有限公司完成；pENTR D-T0P0 克隆試劑盒(貨號為K2400_20)購自Invitrogen公司；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；大腸桿菌JM109、農桿菌GV3101由本實驗室保存。實施例I、水稻葉綠體硫氧還蛋白基因0sTrx8的克隆以水稻日本晴(fl Sativa L)為材料，取葉片少許，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照 Trizol試劑盒說明書提取總RNA。所得水稻葉片總RNA的電泳結果顯示主帶清晰完整，28S 和18S的條帶亮度比約為2:1，說明RNA的濃度和純度符合實驗要求，可以用于合成雙鏈 cDNA。以所得水稻葉片總RNA為模板，按照M-MLV逆轉錄酶說明書，使用Oligo (dT)引物進行逆轉錄獲得第一鏈cDNA。在水稻基因組注釋項目(http://rice.plantbiology.msu.edu/ca/gene_ fams/5_8. shtml)數據庫中進行假定功能搜索,搜索到43個與硫氧還蛋白相關的基因，選擇座位為L0C_0s09g07570的基因，其描述為編碼具有催化能力的鐵硫氧還蛋白酶基因， 經預測表明為葉綠體前體。我們把它命名為水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS。根據Genbank中登陸的序列,利用Primer 5. 0和Oligo 6. 0軟件設計水稻葉綠體硫氧還蛋白基因 fefnS 特異引物，上游引物 0sTrx8Y :5’ -caccatggcggccttcacctcc-3’ (SEQ ID No. 2), 下劃線部分為接頭序列；下游引物 flsrnSR :5’- caacctccaaagcactctcaatct-3’(SEQ ID No. 3)。以逆轉錄獲得的第一鏈cDNA為模板，采用水稻葉綠體硫氧還蛋白基因OsTrxS特異引物OsTrxS 和OsTrxl并用高保真DNA聚合酶pfu進行PCR擴增，PCR反應條件為 94°C預變性4分鐘；然后94°C變性30秒，60°C復性30秒，72°C延伸2分鐘，共32個循環； 最后72°C延伸10分鐘。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳顯示在500-600bp處有單一的特異本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王貴學，康振輝，黃俊麗，張筱娟，
申請(專利權)人：重慶大學，
類型：發明
國別省市：
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