一種維持魚類腸細胞增殖分化的原代培養方法技術

本發明專利技術公開了維持魚類腸細胞增殖分化的原代培養方法，包括以下步驟：1)、按常規方法將魚體表消毒，無菌取出整個內臟，去除腸道表面的系膜組織，洗凈腸道內容物；2)、將腸道剪切成2～3mm的組織小塊；3)、用混合液消化分離腸細胞，得到魚腸細胞和細胞團；4)、用離心方法分離純化得到魚腸細胞團；5)、將分離純化的魚腸細胞團計數接種于膠原蛋白涂抹的培養板中進行培養；6)、接種的魚腸細胞團在24～26℃條件下原代培養，細胞貼壁生長，增殖分化。本發明專利技術根據魚類腸道組織結構特點，摸索了最佳的魚腸細胞分離酶的種類、使用濃度和腸細胞團的純化方法。采用商品膠原蛋白涂抹方便涂抹細胞培養器皿，摸索了最佳的魚腸細胞接種和密閉培養條件。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種動物腸細胞分離和培養方法，具體涉及一種魚腸細胞分離、純化和原代培養方法。
技術介紹
魚類腸細胞為腸道主要功能性細胞，參與腸道營養物質的消化吸收、免疫屏障和應激反應等多種重要生理過程。同時，腸細胞還是增殖分化最快的一類細胞，對維持腸道黏膜上皮功能正常非常重要。由于神經、體液和許多類群細胞與腸細胞間存在廣泛的相互作用，使體內試驗研究腸細胞非常困難。而腸細胞體外培養研究模型為研究腸細胞增殖、分化凋亡，營養物質吸收利用及轉化提供了準確的手段，是探討營養物質對腸細胞營養作用機制、重金屬及其它有毒有害物質對腸道損傷與腸道修復機制、篩選有益魚類腸道健康的功能性飼料的理想模型。因此，依據腸細胞的生物學特點，建立體外魚腸細胞培養研究模型， 對于各相關領域的研究非常重要。目前魚類腸細胞原代培養已有研究。其方法是采用單一的膠原蛋白酶分離魚腸細胞，利用魚皮膠原蛋白為腸細胞貼壁支持物，在二氧化碳培養箱中培養。由于現有培養方法條件要求高，在科學試驗研究中應用很少。主要問題表現在以下幾個方面(1)現有的魚腸細胞分離單一使用膠原蛋白酶，需要酶量較大，細胞損傷嚴重，產率低。腸細胞團比例小，腸細胞貼壁生長困難，細胞接種數量需要量大。因此，需要研究一種更有效的魚腸細胞分離方法，使分離的腸細胞受損更小，細胞團比例大，增殖分化能力更強。(2)現有的魚腸細胞貼壁培養方法使用魚皮膠原蛋白涂抹促進腸細胞貼壁，由于魚皮膠原蛋白制作程序繁復，無商品試劑購買，實踐使用比較困難。因此，需找一種更方便的涂抹材料，以保證接種魚類腸細胞的貼壁生長效果更好。(3)現有魚腸細胞原代培養方法采用二氧化碳培養箱進行培養，易受污染，使得培養操作過程比較復雜。因此，尋找一種更為簡便的培養方法非常必要。(4)谷氨酰胺是細胞體外培養生長的重要營養物質之一。由于魚類對谷氨酰胺的代謝利用與陸生溫血動物相比差異很大。因此，有必要優化調整谷氨酰胺的使用量。故本研究主要致力于建立簡便有效的魚腸細胞分離和方法，以供研究魚腸細胞增殖分化和代謝等的需要。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種簡便有效魚類腸細胞的分離和原代培養方法。為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種魚類腸細胞分離和原代培養方法，依次包括以下步驟1、按常規方法將魚體表消毒，無菌取出整個內臟，去除腸道表面的系膜組織，洗凈3腸道內容物。2、用眼科剪將腸道剪切成2 3mm的組織小塊。3、用膠原酶和中性蛋白酶混合液消化分離腸細胞，得到魚腸細胞和細胞團。4、用離心方法分離純化得到魚腸細胞團。5、將分離純化的魚腸細胞團計數接種于膠原蛋白涂抹的培養板中進行培養。6、接種的魚腸細胞團在M 條件下原代培養，細胞貼壁生長，增殖分化。作為本專利技術的魚腸細胞體外培養方法的改進步驟幻腸細胞消化分離處理包括以下內容A、混合酶消化液中膠原蛋白酶XI濃度為50IU/ml，中性蛋白酶I濃度為20ug/ ml οB、腸道組織小塊與混合消化液的質量體積比大約為1 10。C、組織小塊消化液溫度為25°C恒溫搖床中，100轉/分振蕩消化70分鐘。作為本專利技術的魚腸細胞體外培養方法的改進步驟4)腸細胞團的分離純化包括以下內容用S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培養液)洗滌分離純化得到的細胞團。作為本專利技術的魚腸細胞體外培養方法的改進步驟幻腸細胞團的適宜接種數量處理包括以下內容A、利用商品膠原蛋白涂抹細胞培養器皿。B、將分離到的細胞團懸液稀釋后在血細胞計數板上計數，以350個細胞團/平方厘米的濃度接于膠原蛋白包被的培養器皿。作為本專利技術的魚腸細胞體外培養方法的改進步驟6)腸細胞團的培養條件處理包括以下內容A、培養溫度以25 為宜。B、所用細胞生長培養液含2. 5%胎牛血清，10yg/ml胰島素，40μ g/ml轉鐵蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素的DMEM培養液。C、培養液中加入lOmmol/1 Hepes維持pH穩定，密閉培養細胞。與現有技術相比，本專利技術的魚腸細胞原代培養方法具有以下明顯的優點1、本專利技術首次提出用混合酶液消化分離魚類腸細胞的方法。2、本專利技術根據魚類腸道組織結構特點，摸索了最佳的魚腸細胞分離酶的種類、使用濃度和腸細胞團的純化方法。3、采用商品膠原蛋白涂抹方便涂抹細胞培養器皿，摸索了最佳的魚腸細胞接種和密閉培養條件。4、本專利技術所述的培養條件和方法，能夠幫助初次進行細胞培養的研究人員，比較順利的完成魚類腸細胞的分離和原代培養。附圖說明圖1分離良好的鯉魚腸細胞團；分離的腸細胞團結構完整，數量多，所占比大。圖2接種時的鯉魚腸細胞團；細胞團和細胞已附著在培養器皿的膠原大白涂抹層上。圖3接種培養160小時后生長良好的鯉魚腸細胞形態；細胞數迅速增加，形成單層并融合成片，為典型的上皮型細胞。圖4不同濃度谷氨酰胺對魚腸細胞增殖的影響。谷氨酰胺能促進魚腸細胞增殖， 各處理組細胞增殖率分別為35. 24%,81. 53%U08. 07%U16. 56%和114. 65%。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。以下實施例中所用生長培養液的具體配方為01^11培養基，2.5%胎牛血清， 10 μ g/ml胰島素，40μ g/ml轉鐵蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素。其配制方法如下在200ml DMEM培養基中加入5ml標準胎牛血清、0. 2mg胰島素、0. 4mg轉鐵蛋白、220mg谷氨酰胺、0. 84g碳酸氫鈉、40000IU的青霉素、 40000IU的鏈霉素。實施例1 一種魚腸細胞分離和原代培養方法，依次進行以下步驟1、將體重50克左右鯉魚2尾，去頭，破壞脊髓。體表用75%酒精棉球常規擦拭滅菌，用眼科剪開腹腔，取出整個內臟，放入一個盛有30ml Hanks液的培養皿中。2、用不銹鋼小鑷子將腸道分離出來，剪取腸道從腸球后面到腸道最后一個自然折前面所有的部分，放入盛有30ml Hanks液的培養皿，小心去除腸道表面的系膜組織，后用注射器將腸腔沖洗干凈。3、稱重沖凈后的腸道組織，然后用眼科剪剪切成2 3mm的組織小塊。用Hanks液將沖洗腸道組織小塊沖洗干凈后，移到50毫升的細胞培養瓶，待到組織小塊沉淀下來后， 移去多余的Hanks液，得到大約3g組織小塊。4、加入30ml混合消化液，混合消化液中膠原蛋白酶XI為50IU/ml，中性蛋白酶I 為20ug/ml，并加入30000IU青霉素，30000單位鏈霉素，于25 °C恒溫搖床中，振蕩器轉速 100轉/分，振蕩消化70分鐘。不同消化酶濃度所對應的消化結果如表1所示表1 不同消化酶濃度分離細胞、細胞團的比例(％ )膠原蛋白酶XI(U/ml)中性蛋白酶I(20ug/ml)細胞細胞團30010088121506083178040802050207030 不同濃度消化試驗確定其最佳消化酶濃度為膠原蛋白酶XI為50IU/ml，中性蛋白酶 I 為 20ug/ml。 5、輕輕反復吹打消化后的組織塊3分鐘后，用15毫升S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培養液)洗滌分離消化細胞培養瓶中的殘留物，將洗液轉移到50ml離心管中，蓋好蓋子，1000轉本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：周小秋，姜俊，馮琳，劉揚，胡凱，姜維丹，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：