本發明專利技術公開了一種重組人IFNα2b乳腺表達載體，該乳腺表達載體是pBCN-IFN-pA-EGFP，它是由擴增所得的beta-酪蛋白啟動子和ployA序列、人IFNα2b基因、EGFP的表達盒按順序ployA-IFNα2b-酪蛋白啟動子-EGFP表達盒插入到pMD18-T而得。本發明專利技術還公開了該乳腺表達載體的構建方法。本發明專利技術為利用哺乳動物乳腺生物反應器生產重組人IFNα2b提供了基礎。而且，應用本發明專利技術生產的重組人IFNα2b的生物學活性高、產量大、生產成本低，可產生巨大的經濟效益和社會效應。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，尤其是一種重組人IFNa 2b乳腺表達載體及其構建方法和應用。
技術介紹
人干擾素2b (IFN α 2b)是一種具有干擾病毒復制，抑制細胞分裂增殖，抑制和殺傷腫瘤等生物學活性的細胞因子，是臨床上治療乙肝、丙肝等病毒性疾病和一些癌癥的關鍵藥物。目前，在臨床上大量使用的重組人IFNa 2b均為大腸桿菌表達。由于大腸桿菌是原核生物，缺乏與蛋白質翻譯后修飾相關的重要酶類，使得所表達的重組人IFNa 2b缺少決定生物活性的化學修飾和空間折疊，直接導致了在治療效果上的折扣。更嚴重的是，錯誤折疊的重組人IFN α 2b在對病人的治療過程中，會刺激人體產生能中和IFN α 2b的抗體，進一步降低治療效果。利用哺乳動物細胞系表達IFN α 2b，可以生產具有完全生物活性的重組人IFNα 2b，但此種方式的生產成本過高，且細胞培養條件要求苛刻，表達量低，純化工藝復雜，遠遠不能滿足IFNa 2b的市場需求。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種重組人IFNa 2b乳腺表達載體及其構建方法和應用。解決上述技術問題本專利技術采用如下技術方案重組人IFNa 2b乳腺表達載體，該乳腺表達載體是pBCN-IFN-pA-EGFP。pBCN-IFN-pA-EGFP由擴增所得的beta-酪蛋白啟動子和ployA序列、人IFNa 2b 基因、EGFP的表達盒按順序ployA-IFN a 2b-酪蛋白啟動子-EGFP表達盒插入到pMD18_T而得。上述重組人IFNa 2b乳腺表達載體的構建方法，主要包括以下步驟<1>根據GenBank中收錄的娟姍牛beta-酪蛋白啟動子和ployA序列，Genbank accession No. JN559864，設計引物，并以娟姍牛血液基因組DNA為模板，擴增出beta-酪蛋白啟動子和PIoyA序列；<2> 根據 GenBank 中收錄的人 IFN α 2b 基因，Genbank accession No. AY255838. 1， 設計引物，并以人血液基因組為模板，擴增獲得人IFNa 2b基因；<3>根據BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP-Cl載體的全序列設計引物，擴增出EGFP的表達盒；<4>按順序將所擴增得到的序列插入到PMD18-T中，順序為ployA-IFN α 2b_酪蛋白啟動子-EGFP表達盒，即得乳腺表達載體pBCN-IFN-pA-EGFP。上述重組人IFNa 2b乳腺表達載體的應用，將該b乳腺表達載體轉化到哺乳動物中，以促使其乳腺高效表達重組人IFN α 2b。哺乳動物為小鼠。轉化是用Pvu I單酶切pBCN-IFN-pA-EGFP表達載體，切除pMD_18T骨架，回收含有IFN α 2b基因和EGFP基因的片段，回收的基因片段分別溶于無內毒素的TE溶液，調整溶液濃度至2ng/y L，然后注射到小鼠的受精卵的原核中，再將受精卵抑制到同期發情的代孕母鼠輸卵管中，產生自代，鑒定，得到轉基因小鼠。回收是低熔點瓊脂糖凝膠回收，具體是取3 4 μ g酶切的表達載體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳后，切下需回收的DNA條帶所在位置的凝膠，采用Qiagen公司可回收101Λ以上的DNA片段的凝膠回收試劑盒進行回收。本專利技術的重組人IFNa 2b乳腺表達載體及其構建方法，為利用哺乳動物乳腺生物反應器生產重組人IFNa 2b提供了基礎。通過胚胎顯微操作技術將表達載體轉入哺乳動物的基因組中獲得轉基因動物，從而在轉基因動物的乳腺中高效表達重組人IFNa 2b等其他重要的藥用蛋白。此種方式成本低(轉基因動物的飼養條件、飼料構成與普通動物無異， 不需額外的投入)，乳腺生物反應器產量高和純化方便(乳汁成分明確，蛋白質種類較少)， 乳汁中的含量為30 μ g/L(約為細胞系表達量的10倍)。對所表達的重組人IFN α 2b生物活性進行檢測后發現，比活度約為2. SXlO7IU,并且能在WISH細胞系中顯著刺激抗病毒白 MxA的表達。因此，應用本專利技術生產的重組人IFNa 2b的生物學活性高、產量大、生產成本低，可產生巨大的經濟效益和社會效應。附圖說明圖1是重組人IFN α 2b的乳腺表達載體pBCN-IFN-pA-EGFP的構建過程。圖2是Pvu I酶切乳腺表達載體pBCN-IFN-pA-EGFP的電泳圖，其中，Ml表示 λ DNA/Hind ΠΙ DNA marker。泳道1為Pvu I酶切后的結果，泳道2為環狀質粒。M2為 Supercolied DNA ladder marker。乳腺表達載體 pBCN-IFN-pA-EGFP 經 Pvu I 酶切后，可切出兩條帶，一條為11. Ikb的含有IFNα 2b和EGFP的表達盒。另一條為11Λ的pMD18_T 骨架；圖3是PCR鑒定表達載體整合的陽性轉基因小鼠的電泳圖，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1，6，7號分別為3只轉基因Rnmder小鼠PCR結果，上下兩個條帶， 分別為兩個不同檢測引物的擴增結果。其他泳道為見條帶，均為陰性小鼠對照；圖4是檢測轉基因小鼠基因組中IFN c^b基因整合的Southern blotting雜交圖，其中，M表示11Λ梯度DNA分子量標準，1，6，7泳道分別為3只轉基因Founder小鼠，其他泳道均為陰性小鼠對照；圖5是PCR鑒定表達載體整合的陽性轉基因小鼠的電泳圖，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1-14號均為Fl代小鼠PCR結果，4號泳道的擴增不明顯，判定為轉基因陰性。BC泳道為空白對照。上下兩個條帶，分別為兩個不同檢測引物的擴增結果；圖6是檢測轉基因小鼠基因組中IFNc^b基因整合的Southern blotting雜交圖， 其中，M表示11Λ梯度DNA分子量標準，8-13號泳道分別為Fl代轉基因小鼠，NC泳道為陰性小鼠對照；圖7是檢測轉基因小鼠乳汁中重組人IFNa沘表達情況的western blotting圖， 6,8,9,11，12，13泳道分別為轉基因小鼠Fl代乳汁的雜交結果，WT為陰性對照小鼠乳汁的雜交結果，分別用鼠抗人IFNa 2b抗體和鼠抗His標簽抗體進行雜交。均在M-25KD處有雜交條帶出現；圖8是轉基因小鼠制備的流程圖。圖9是轉基因小鼠乳汁中重組人IFNa 2b的生物學活性測定。圖10是轉基因小鼠乳汁中重組人IFNa 2b的比活度的定量測定。具體實施例方式以下所用的載體和試劑來源pMD18_T載體，購自TaKaRa公司，pEGFP-Cl載體， 購自BD Biosciences Clontech公司，引物合成及序列測定均由上海生工生物工程有限公司完成，Taq酶、T4DNA連接酶、內切酶及熒光定量相關試劑均購自大連TaKaRa公司，鼠抗人IFN α 2b單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗His標簽單克隆抗體購自Abmart公司，羊抗鼠HRP酶標二抗購自天根公司。人IFN α 2bELISA檢測試劑盒購自R&D公司，人羊膜上皮細胞系WISH細胞購自中國科學院上海細胞庫。重組人IFN α 2b標準品購自安徽安科生物。 pGL3-Basic和pRL_TK以及本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種重組人ＩＦＮα２ｂ乳腺表達載體，其特征在于該乳腺表達載體是ｐＢＣＮ－ＩＦＮ－ｐＡ－ＥＧＦＰ。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：石德順，李輝，劉慶友，崔奎青，
申請(專利權)人：廣西大學，
類型：發明
國別省市：45
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