一種利用RNAi技術培育抗黑條矮縮病水稻的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用RNAi技術培育抗黑條矮縮病水稻的方法，適用于水稻防治水稻黑條矮縮病，屬于生物和現代農業技術領域的應用技術。本發明專利技術通過構建含有水稻黑條矮縮病病毒S8部分片段的RNAi表達載體，利用農桿菌介導的轉基因方法將RNAi載體轉入水稻的胚性愈傷組織，通過潮霉素抗性基因篩選、分化、生根壯苗，獲得再生轉基因植株和株系。該方法利用RNAi技術，可培育出對黑條矮縮病表現抗性的水稻轉基因株系，從根本上解決水稻黑條矮縮病問題，顯著增強水稻對該病的抗性，提高經濟效益，同時為綠色環保農業提供有力的技術支持。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于轉基因植物的培育
，屬于生物和現代農業
的應用技術。
技術介紹
水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒(Rice Black-streaked Dwarf Virus,RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飛虱為傳播介體。該病曾于20世紀60年代廣泛發生在我國華東諸省市，此后3年，由于麥田翻耕和早稻移栽等耕作方式的興起，滅殺了第一代灰飛虱若蟲，病害的初侵染受阻，發病面積逐年下降。80年代后，由于擴種小麥，又給本病初侵染創造了有利的寄主條件，致使本病在90年代中期回升流行，在浙江、上海、江蘇、安徽、江西和福建省北部等長江中下游地區廣泛發生，造成嚴重的經濟損失。近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推廣，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、江西和福建大規模發生。目前，對水稻黑條矮縮病的防治主要是使用農藥防治傳毒介體灰飛虱，但由于介體昆蟲種群數量大，防治效果不佳。眾所周知，培育抗病品種是減輕農作物病蟲害最為經濟、有效、環保的途徑。但目前尚沒有篩選出對黑條矮縮病具有較好抗性的水稻品種，一旦黑條矮縮病大規模爆發，在沒有抗黑條矮縮病新品種迅速推出的情況下，將會對水稻生產造成巨大經濟損失。因此，篩選或創制抗黑條矮縮病種質資源是目前水稻黑條矮縮病品種改良最為迫切的課題。RNA干擾(RNAi，RNA interference)是指在進化過程中高度保守的、有雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象，是真核生物中一種普遍存在且非常保守的機制。由dsRNA介導的干擾現象作為細胞的一種防御機制可針對性地降解細胞內與之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，達到對病毒的抵抗，同時還調節細胞內編碼基因的表達，為利用RNA介導的病毒抗性進行抗病毒基因工程的研究奠定了基礎。目前，RNAi已經廣泛用于農作物抗病抗蟲種質資源的創制。目前還未見利用RNAi技術培育抗黑條矮縮病水稻的報道。
技術實現思路
本專利技術的主要目的就是針對上述水稻黑條矮縮病的研究現狀，提供一種利用RNAi 技術培育抗黑條矮縮病水稻的方法。為了實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案如下 以SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列作為抗水稻黑條矮縮病的目的基因序列，分別以下述1對引物F1/R1進行PCR擴增，擴增得到黑條矮縮病病毒S8部分片段序列，設計上下游引物5’端引入限制性內切酶位點I和分e I，酶切位點外側添加4個保護堿基以保證酶切完全，引物序列如下Fl: aaaaGGATCCACCTGTTTGGGCTTCTCA； (SEQ ID NO. 2) Rl: aaaaACTAGTAACCTGCCATAATCATCAC； (SEQ ID NO. 3)3將得到的目的基因序列經限制性內切酶ife // I和分e I酶切形成粘性末端，再用與其相同的限制性內切酶酶切中間載體P1022，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收酶切的目的條帶，連接克隆入P1022載體中，形成含正反向重復目的片段的中間載體pl022-S8-2 ；用限制性內切酶分別酶切中間載體P1022-S8-2，以及植物表達載體pl30mbiNoS，電泳回收目的條帶后將含正反向重復序列的目的片段連接到pl30mbiNos載體中，即為構建成功的植物表達載體pl30mbiNos-S8 ；將植物表達載體pl30mbiNos-S8，利用農桿菌介導法分別轉入水稻品種的胚性愈傷組織，通過潮霉素篩選、分化、生根壯苗，獲得轉基因植株。本專利技術所說的方法，具體步驟如下(1)水稻黑條矮縮病毒S8部分片段RNAi載體的構建1)分別以下述F1/R1為引物，水稻黑條矮縮病病毒總RNA為模板，進行PCR擴增獲得序列如SEQ ID NO. 1所示的述的S8部分片段序列，再將S8部分片段分別克隆到pMD18_T， 得 pMD-S8 ；2)構建含反向重復序列的中間載體P1022-S8-2①構建含正向序列的中間載體P1022-S8-1將pMD-S8和ρ 1022經BeimH I和分e I酶切獲得的片段進行連接，分別得到 P1022-S8-1 ；②構建含反向重復序列的中間載體P1022-S8-2將①中得到的含正向序列的中間載體P1022-S8-1用限制性內切酶酶勒·/ II和損a I 進行酶切，回收酶切的目的條帶，將其與BamH I和Spe I酶切pMD_S8獲得的S8基因序列進行連接，得到含反向重復目的片段的中間載體，命名為P1022-S8-2;③構建含反向重復序列的表達載體pl30mbiNos-S8BernH HWSac I雙酶切含反向重復目的片段的中間載體pl022_S8_2，用同樣的限制性內切酶酶切植物表達載體pl30mbiNos，分別回收反向重復序列和植物表達載體片段，T4 DNA連接酶連接，得到的陽性克隆分別為pl30mbiNoS-S8 ；(2)將植物表達載體pl30mbiNoS-S8，利用農桿菌介導法分別轉入水稻胚性愈傷組織，通過潮霉素篩選、分化、生根壯苗，即獲得再生轉基因植株。經過多代自交、分子檢測和抗性鑒定，表明所獲得的轉基因株系對水稻黑條矮縮病具有較好抗性。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是本專利技術方法利用RNAi技術，可培育出具有優良抗黑條矮縮病的轉基因水稻株系，顯著增強水稻對黑條矮縮病的抗性，提高其產量和經濟效益。附圖說明圖1為植物表達載體pl301UbiNos。酶切位點依次為及 /7 I，分e I,Kpn I和feeI。圖2為中間載體P1022，其多克隆位點區插入了一段內含子，酶切位點依次為 BamH I, Kpn I, Iba l,Bgl II 禾口 fee I。圖3為PCR擴增S8基因目的片段的電泳檢測結果圖1，DL，2000分子量標記；2-4，以表現黑條矮縮病癥狀的感病水稻植株mRNA為模板擴增的S8基因片段。圖4為含S8基因片段正向序列中間載體pl022-S8-l用及 /7 I和分e I雙酶切鑒定電泳檢測結果圖1，DL，2000分子量標記；2-4，pl022-S8-l用I和分e I雙酶切， 其中，2為陰性，3-4為陽性。圖5為含S8基因片段反向重復序列中間載體pl022-S8-2用及 /7 /和fee I雙酶切鑒定電泳檢測結果圖l-2，pl022-S8-2用/和fee I雙酶切；3，DL，2000分子量標記。圖6為含S8基因片段反向重復序列表達載體pl301UbiNos_S8用召affl/7 I和fee I 雙酶切鑒定電泳檢測結果圖1_3，pl301UbiNos-S8用及 /7 I和fee I雙酶切；4，DL, 2000 分子量標記。圖7為轉基因植株的潮霉素基因PCR鑒定1_6，部分轉基因植株；7-8，陰性對照； 9，陽性對照；10，DL, 2000分子量標記。圖8為實施例3中，轉基因株系和對照接毒后黑條矮縮病的發病率。發病率為3 次重復的平均值。不同平均數后的星號表示差異顯著水平，**表示0.01水平差異顯著。圖9為實施例4中，半定量RT-PCR檢測接毒鑒定的轉基因株系及對照中目標基因表達水平1，DL，2000分子量標記；2，未接種武運粳7號植株；3_4，接種武運粳7號植株； 5-8，分別為RNAil-RNAi4轉基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種利用ＲＮＡｉ技術培育抗黑條矮縮病水稻的方法，其特征在于：　　　分別以下述１對引物Ｆ１／Ｒ１進行ＰＣＲ擴增，從水稻基因中擴增得到黑條矮縮病病毒Ｓ８部分片段，其序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示：Ｆ１：　ａａａａＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴＣＡ；Ｒ１：　ａａａａＡＣＴＡＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＡＴＡＡＴＣＡＴＣＡＣ；將得到的目的基因序列經不同限制性內切酶酶切形成粘性末端，再用與其相同的限制性內切酶酶切中間載體ｐ１０２２，于１．０％瓊脂糖凝膠電泳分離后回收酶切的目的條帶，連接克隆入ｐ１０２２載體中，形成含反向重復目的片段的中間載體ｐ１０２２－Ｓ８；用限制性內切酶分別酶切中間載體　ｐ１０２２－Ｓ８，以及植物表達載體ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ，電泳回收目的條帶后將含正反向重復序列的目的片段連接到ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ載體中，即為構建成功的植物表達載體ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ－Ｓ８；將植物表達載體ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ－Ｓ８導入農桿菌，利用農桿菌介導法分別轉入水稻的胚性愈傷組織，通過潮霉素篩選、分化、生根壯苗，即獲得再生轉基因植株。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁國華，周勇，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：32