一種具抑菌活性的短肽及其應用制造技術

本發(fā)明專利技術公開了一種具抑菌活性的短肽，它具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明專利技術還公開了所述短肽在制備抗細菌藥物中的應用，實驗證實：本發(fā)明專利技術的短肽抗菌譜廣，無論是G+菌、還是G-菌，都能被它很好地抑制，而且對真菌的抑制作用也很明顯，提示其在抗細菌藥物開發(fā)和應用方面有重要價值。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬生物醫(yī)學領域，尤其涉及一種具有顯著抑菌活性的短肽及其應用。
技術介紹
抗菌藥物的廣泛使用，大大降低了人類受細菌感染引起死亡的威脅，也產(chǎn)生了一些新的問題，如細菌的耐藥性。致病菌的耐藥性已經(jīng)日益嚴重地威脅著人類的健康。目前多數(shù)的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應的耐藥性致病株系，尋找全新類型的抗菌藥物成為解決耐藥性問題的又一課題。抗菌肽是指分布于生物體內(nèi)具有抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)突變細胞的一類小分子多肽，與抗生素不同，抗菌肽是特定基因編碼的產(chǎn)物，它通過破壞細胞膜通透性使細胞內(nèi)容物外流，最終導致細菌死亡。因此它不會使細菌產(chǎn)生抗藥性，因而避免了超級細菌的產(chǎn)生。近年來，肽在人體中的作用已引起科學界的高度重視。隨著醫(yī)學及生化技術的發(fā)展，多肽類藥物將成為21世紀重要的診斷、監(jiān)測、預防和治療藥。因此，開展多肽藥物的研究具有重要意義。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一種具有顯著抑菌活性的短肽及其應用。本專利技術所述具有抑菌活性的短肽，其特征在于所述短肽為SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本專利技術提供的具有抑菌活性的短肽不需任何修飾連接，且人工合成方便；試驗證明具有顯著的抑菌功能，同時對正常細胞無毒性。本專利技術所述短肽在制備抗細菌藥物中的應用。功能實驗顯示本專利技術所述短肽抗菌譜很廣，無論是G+菌(革蘭氏陽性菌)、還是 G—菌(革蘭氏陰性菌)，都能被它很好地抑制，而且對真菌的抑制作用也很明顯。提示其在抗細菌藥物開發(fā)和應用方面有重要價值。進一步的功能實驗顯示本專利技術的短肽對細菌的抑制作用在IOmin之內(nèi)就開始發(fā)揮，20min后抑制率即可達80%，45min后就可達到90%以上。本專利技術的短肽不僅抗菌作用很強，而且穩(wěn)定性好，不僅在100°C煮沸l(wèi)Omin，活性還能保持80%，而且在酸、堿的環(huán)境中還能發(fā)揮其良好的抑菌作用。鑒于上述短肽的性質(zhì)和功能，本領域普通技術人員可以利用分子生物學技術，根據(jù)氨基酸與密碼子的對應關系反推出核酸序列作為功能基因，用于制備轉(zhuǎn)基因動物或植物以表達功能蛋白，并用于藥物的開發(fā)和臨床治療。具體實施例方式實施例1本專利技術所述短肽的設計與合成1、依據(jù)目前國際主要抗菌肽數(shù)據(jù)庫(http //www. imtech. res. in/raghava/ antibp/ ；http//aps.unmc. edu/AP/main. php ；http//www. bbcm. univ. trieste. it/ ； http://penbase. immunaqua. com/)中登陸的抗菌肽的序列，分析其一級結(jié)構與活性的關系的對應關系，設計人工短肽序列。 2、利用蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫http://WWW. expasy. org/分析已知活性的多肽序列與設計的多肽序列的二級結(jié)構的相似度，結(jié)合其它物理化學參數(shù)預測進行設計序列的修正。3、將設計的人工短肽序列送至生物公司合成或利用自動多肽合成儀合成序列。 HPLC檢測純度要大于96%，同時通過質(zhì)譜檢測確定多肽合成質(zhì)量。樣品以凍干狀態(tài)保存。4、合成后的多肽進行抑菌功能檢測篩選。5、通過功能檢測，最終獲得具有抑菌功能的多肽序列，其氨基酸序列具體是:Arg Gln Lys Arg Pro Glu Arg Lys Asn Thr Gly Phe Leu Pro Glu Arg lie Pro Pro。實施例2利用液體生長抑制法檢測本專利技術所述短肽的抑菌活性2. 1材料、試劑1)本專利技術所述短肽由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，氨芐青霉素 (Amp)為solarbio公司產(chǎn)品，一次性濾器，為美國PALL公司產(chǎn)品，其它藥品試劑為國產(chǎn)分析純。2)選用革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subti lis (Ehrenberg) Cohn)、 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、藤求菌(Sarcina ureae)、蘇云金芽 包桿菌(Bacillus thuringiensis) > 巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)；革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)、 弧菌(Vibrio)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、變形桿菌(Proteus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)；真菌 爺病鐮刀菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜類炭疽病菌 (Colletetrichum lagenarium)、蘋果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)進行測試。3)封閉液0. 4% BSA(w/v),0. 02%冰醋酸，配制后過濾除菌。4) PB 液體培養(yǎng)基(PH 7. 4-7. 6)胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化鈉(NaCl)5g/L2.2 實驗1)向無菌96孔酶標板所使用的孔中加入200 μ L封閉液，室溫封閉24h。2)用PB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)上述各種細菌，轉(zhuǎn)培養(yǎng)使細菌處于對數(shù)生長期。用 PB培養(yǎng)基調(diào)整菌液0D_約為0. 002。3)酶標板棄去封閉液，每孔加90 μ L步驟2)所述菌液，再加入用10 μ L無菌水配好的各種濃度梯度(濃度范圍lmg/mL 60mg/mL)的本專利技術所述短肽。陰性對照為90yL 菌液+10 μ L無菌水；陽性對照為90 μ 1菌液+10 μ L濃度為0. 25mg/mL氨芐青霉素溶液(終濃度為 0. 025mg/mL,約 62 μ M)。4)將加好菌液和藥品的酶標板置于28°C搖床，IOOrpm恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后 0h、3h、12h、15h、24h、36h，用 BIOTEK ELX800 酶標儀測定每孔的 630nm 吸光值(OD63tl)。 5)利用SigmaplotlO和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，本專利技術的短肽對無論是對G+菌、還是對G_菌都能被它很好地抑制，而且對真菌的抑制作用也不錯；15mg/mL 50mg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度越大抑菌效果越明顯。提示其在抗細菌藥物開發(fā)和應用方面有重要價值。實施例3以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。質(zhì)量濃度為40mg/mL的本專利技術短肽，分別在作用大腸桿菌(Escherichia coli) IOmin, 25min, 45min, 60min 禾口 90min 后涂板。大腸桿菌抑制曲線顯示本專利技術的短肽對細菌的抑制作用在IOmin之內(nèi)就開始發(fā)揮，20min后抑制率即可達80%，45min后就可達到90%以上。實施例4以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。將本專利技術的短肽溶液(40mg/mL)分成8份，分別于100°C加熱Omin，lmin,2min, 4min, 8min, 15min, 20min, 40min后進行抑菌實驗，每個加熱時間做3個平行組，同時做空白對照組。結(jié)果顯示本專利技術的短肽在100°C加熱Smin后，其抑菌活性基本上沒有變；但隨著加熱時間的延長，抑菌活性有所降低，到1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
１．一種具抑菌活性的短肽，其特征在于：所述短肽為ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示的氨基酸序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張尚立，張恒，常宏文，曹慧仁，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發(fā)明
國別省市：88