本發明專利技術涉及一種細胞，該細胞相對于其野生型被遺傳修飾并具有性能ａ）或ｂ）中的至少一種性能：ａ）與其野生型相比，催化丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶Ｅ１、或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶Ｅ１ｂ的活性增加，ｂ）與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變為β－丙氨酸的酶Ｅ２的活性增加，其中，除性能ａ）或ｂ）之外，該細胞的特征為性能ｃ）或ｄ）的至少一種性能：ｃ）該遺傳修飾的細胞能夠將β－丙氨酸輸出細胞外，ｄ）該遺傳修飾的細胞能夠將β－丙氨酸轉變為３－羥基丙酸。本發明專利技術還涉及制備遺傳修飾的細胞的方法，可用這種方法獲得的遺傳修飾的細胞，制備３－羥基丙酸的方法，制備丙烯酸的方法，制備聚丙烯酸酯的方法、制備丙烯酸酯的方法和該細胞用于制備３－羥基丙酸的用途。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及相對于其野生型被遺傳修飾的細胞、制備遺傳修飾的細胞的方法，可 用這種方法獲得的遺傳修飾的細胞，制備3-羥基丙酸的方法，制備聚丙烯酸酯的方法，制 備丙烯酸酯的方法和該細胞用于制備3-羥基丙酸的用途。
技術介紹
丙烯酸是工業上很重要的原料化合物。它特別地用于制備聚丙烯酸酯，尤其是交 聯、部分中和的聚丙烯酸酯，這種聚丙烯酸酯干燥且基本上是無水狀態，具有強大的吸水能 力。這些被稱為“超級吸收劑”的交聯聚丙烯酸酯能夠吸收多倍于自身重量的水。由于強大 的吸收性，該吸收聚合物適于摻入吸水結構和物品中，例如嬰兒尿布、失禁產品或衛生巾。 就此而論，參考Modern Superabsorbent PolymerTechnology ；F. L. Buchholz,A. T. Graham, WiIey-VCH,1998。丙烯酸酯，例如丙烯酸甲酯和丙烯酸丁酯同樣是工業上重要的原料化合物，尤其 是在制備共聚物時使用它們。這些共聚物通常以聚合物分散體形式被用作粘合劑、涂抹劑 或紡織品、皮革和紙張助劑。丙烯酸在工業上主要通過丙烯的兩階段催化氣相氧化來制備，丙烯是通過熱裂解 由石油加工產生的汽油獲得的。用這種方法獲得的丙烯酸視需要隨后通過添加醇被酯化。兩階段法制備丙烯酸的缺點首先是兩個階段都使用的300至450°C的溫度導致低 聚物形成和其它不合意的裂化產物。這導致了不合意的大量比丙烯酸沸點更高的化合物， 或僅能困難地與丙烯酸分開的化合物，例如乙酸。這些化合物通常必須通過蒸餾法從丙烯 酸除去，這又對丙烯酸產生進一步的熱負荷以及隨其相伴的二聚體和低聚物的形成。然而， 高含量丙烯酸二聚體或丙烯酸低聚物是不利的，因為當在交聯劑存在下通過丙烯酸自由基 聚合來制備超級吸收劑時，這些二聚體或低聚物嵌入了該聚合物。然而，在聚合后進行的 聚合物顆粒表面的后處理過程中，例如在表面后交聯過程中，聚合入的二聚體被裂解形成 β-羥基丙酸，其在后交聯條件下脫水形成丙烯酸。因此，用于制備超級吸收劑的丙烯酸中 高含量的二聚丙烯酸導致聚合物熱處理過程中丙烯酸單體含量增加，如同后交聯過程中發 生的一樣。在催化氣相氧化獲得的丙烯酸中還可檢測到其他常常有毒的化合物。這些雜質尤 其包括妨礙聚合進程的醛，產生仍含可觀量的可溶組分的聚合物?，F有技術中已經描述了解決這些問題的一些措施(參見例如EP-A 0574260或 DE-A 10138150)。這個制備丙烯酸的常規方法的又一缺點是采用的原料物(丙烯)是由石油產生4的，因此是由不可再生的原材料產生的，特別是長期考慮，從經濟學觀點來看，提取石油是 越來越困難的和成本越來越高的。就此而論，現有技術也描述了 一些措施來抗衡這個問題。因此，WO-A 03/62173描述了制備丙烯酸的方法，由丙酮酸最初發酵形成α -丙氨 酸，然后借助酶2，3-氨基變位酶將α-丙氨酸轉變為β-丙氨酸。β-丙氨酸接著經β-丙 氨酰-CoA、丙烯酰-CoA、3-羥丙酰-CoA，或經丙二酸半醛轉變為3-羥基丙酸，3-羥基丙酸 脫水后得到丙烯酸。WO-A 02/42418描述了例如從可再生原材料制備3_羥基丙酸的又一途徑。在這種 情況下，丙酮酸最初轉變為乳酸，隨后由乳酸形成乳酰_CoA。然后乳酰-CoA經丙烯酰-CoA 和3-羥丙酰-CoA轉變為3-羥基丙酸。WO-A 02/42418中描述的制備3-羥基丙酸的又一 途徑想象了葡萄糖經丙酸、丙酰_CoA、丙烯酰-CoA和3-羥丙酰-CoA的轉變。該出版物還 描述了丙酮酸經乙酰-CoA和丙二酰-CoA轉變為3-羥基丙酸。經各個途徑獲得的3-羥基 丙酸可脫水轉變為丙烯酸。WO-A 01/16346描述了從甘油發酵制備3-羥基丙酸，其中采用表達來自克雷白氏 桿菌(Klebsiella pneumoniae)的dhaB基因(編碼甘油脫水酶的基因)和編碼醛脫氫酶 的基因的微生物。用這種方法，從甘油經3-羥丙醛形成3-羥基丙酸，然后3-羥基丙酸可 以通過脫水轉變為丙烯酸。如上所述用于制備作為合成丙烯酸的原料化合物的3-羥基丙酸的發酵方法的缺 點尤其是發酵溶液中形成的3-羥基丙酸的量，對于使用此發酵溶液作為起始原料以經濟 有利方式來大工業制備丙烯酸來說是太低了。
技術實現思路
本專利技術是基于克服現有技術暴露的缺點的目的。本專利技術尤其基于提供重組微生物或由至少兩種重組微生物組成的重組系統的目 的，這種微生物能夠比現有技術中描述的微生物更好地，特別是更有效地從可再生原材料， 特別是從碳水化合物和/或從甘油制備3-羥基丙酸，接著3-羥基丙酸可在溫度脫水反應 中轉變為純丙烯酸。一種相對于其野生型被遺傳修飾的細胞為實現上述目的提供了貢獻，該細胞具有 性能a)和b)中的至少一種性能，優選具有a)和b)兩種性能a)與其野生型相比，酶的活性增加，優選至少10%，特別優選至少25%，進一步優 選至少50%，進一步更優選至少75%，進一步優選至少100%和最優選至少500%，最大限 度優選高達5000%，特別優選高達2500%，所述酶是催化丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶Ela， 或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶Elb，但是優選催化丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶 Ela'b)與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變為β-丙氨酸的酶E2的活性增加，優選至 少10 %，特別優選至少25 %，進一步優選至少50 %，進一步更優選至少75 %，進一步優選至 少100%和最優選至少500%，最大限度優選高達5000%，特別優選高達2500%，其中，除a)或b)，優選a)和b)之外，該細胞的特征為性能C)或d)的至少一種性 能c)該遺傳修飾的細胞能夠將β -丙氨酸輸出細胞外；d)該遺傳修飾的細胞能夠將β -丙氨酸轉變為3-羥基丙酸。用這種遺傳修飾的細胞本身或與可將β-丙氨酸轉變為3-羥基丙酸的其他細 胞組合能夠從碳水化合物或從甘油形成3-羥基丙酸，因為形成的β -丙氨酸可以轉變為 3_羥基丙酸。“野生型”細胞優選是指基因組處于例如通過進化自然產生的狀態的細胞。該術語 既理解為整個細胞又理解為單獨的基因。因此術語“野生型”不包括尤其是其基因序列至 少部分經歷使用重組方法人工修飾的那些細胞或那些基因。術語“酶的活性增加，，優選是指胞內活性增加。言語“與其野生型相比，酶的活性 增加”也特別包括細胞，其野生型不顯示或至少檢測不到這個酶的活性，其僅在增加酶活性 之后顯示出可檢測到的酶活性，例如通過過表達。就此而論，術語“過表達”或在下列陳述 中使用的言語“表達增加”還包括下面的情況，初始細胞，例如野生型細胞，不顯示或至少檢 測不到酶表達，可檢測的表達僅通過重組方法才可誘導出。原則上，通過以下方法實現酶活性增加是可能的通過增加編碼酶的的一個或多 個基因序列的拷貝數，通過使用強啟動子或通過利用編碼活性增加的相應酶的基因或等位 基因，視需要通過這些方法的組合。根據本專利技術遺傳修飾的細胞例如通過轉化、轉導、這些 方法與載體結合或聯合而產生，該載體包含期望的基因、這個基因的等位基因或其一部分 和能夠表達該基因的載體。異源表達特別是通過將基因或等位基因整合入細胞的染色體或 染色體外復制型載體來實現。DE-A-10031999中給出了增加細胞中酶活性的可能方法的概述，所述酶例如本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
DE 2005-10-10 102005048818.8一種細胞，相對于其野生型被遺傳修飾并具有性能a)和b)a)與其野生型相比，催化丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶E1a、或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變為草酰乙酸的酶E1b的活性增加，b)與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變為β 丙氨酸的酶E2的活性增加，其中，除性能a)和b)之外，該細胞的特征為性能d)d)該遺傳修飾的細胞能夠將β 丙氨酸轉變為3 羥基丙酸。2.權利要求1的細胞，其中酶E1是丙酮酸羧化酶。3.權利要求1或2的細胞，其中酶E1的活性增加是通過野生型細胞的丙酮酸羧化酶基 因的突變實現的。4.前述權利要求之一的細胞，其中酶E2是天冬氨酸脫羧酶。5.前述權利要求之一的細胞，其具有性能d)，其中，與其野生型相比，該細胞具有下列 酶E3至E6中至少一種酶的活性增加-催化β “丙氨酸轉變為β “丙氨酰-輔酶A的酶E3, -催化β “丙氨酰-輔酶A轉變為丙烯酰-輔酶A的酶E4, -催化丙烯酰-輔酶A轉變為3-羥丙酰-輔酶A的酶E5, -催化3-羥丙酰-輔酶A轉變為3-羥基丙酸的酶Ε6。6.權利要求5的細胞，其中酶E3是輔酶A轉移酶或輔酶A合成酶， E4是β -丙氨酰-輔酶A銨裂合酶， E5是3-羥丙酰-輔酶A脫水酶，和E6是輔酶A轉移酶、3-羥丙酰-輔酶A水解酶或3-羥丁酰-輔酶A水解酶。7.權利要求1至4之一的細胞，其具有性能d)，其中，與其野生型相比，該細胞具有下 列酶E7和E8中至少一種酶的活性增加-催化β “丙氨酸轉變為丙二酸半醛的酶E7, -催化丙二酸半醛轉變為3-羥基丙酸的酶Ε8。8.權利要求7的細胞，其中酶E7是β -丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨酶，和 E8是3-羥丙酰脫氫酶或3-羥...
【專利技術屬性】
技術研發人員：A馬克斯，VF溫迪什，D里特曼，S巴克霍爾茨，
申請(專利權)人：贏創德固賽有限責任公司，
類型：發明
國別省市：DE
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