【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥領域，具體涉及抗人血栓調節蛋白單域抗體及其應用。
技術介紹
1、血栓調節蛋白(thrombomodulin,tm)是廣泛存在于血管內皮表面的跨膜蛋白。成熟的血栓調節蛋白含557個氨基酸(19-575aa,p07204)，包括5個主要的結構域(domain)，從n端到c端依次為c-型凝集素樣結構域、6個表皮生長因子樣重復結構、富含絲/蘇氨酸的結構域、跨膜結構域和胞質尾。tm可與凝血酶形成復合物，具有高親和力。該復合物既通過激活蛋白c發揮抗凝血作用，也通過激活凝血酶激活的纖溶抑制劑(thrombin?activatedfibrinolysis?inhibitor,tafi)發揮血栓保護作用(活化的tafi(tafia)抑制纖溶酶介導的纖蛋白溶解)。研究表明tm發揮抗凝或抗纖溶作用與tm濃度相關：低濃度有利于tafi激活，高濃度有利于蛋白c激活。
2、tm可與凝血酶結合并具有高親和力，結合后使凝血酶不能激活血小板或裂解纖維蛋白原，在維持血管中血液非凝固性狀態有著非常重要的作用。當內皮細胞功能受損時，tm從血管內皮細胞表面脫落變成可溶性tm(soluble?thrombomodulin,stm)。stm是臨床上血栓新四項檢測的關鍵指標之一，可作為血管內皮細胞功能受損程度的標志物，正常值約為3-50ng/ml或3.8～13.3tu/ml。
3、臨床上，stm水平升高可提示血管內皮損傷，多與其他指標(如d-dimer)聯合用于血栓風險的評估。目前用于stm檢測的酶免疫分析(enzyme?immu
4、單域抗體(single-domain?antibody,sdab)，源于駝類或鯊魚類體內天然缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy?chain?antibody,hcab)，最早由hamers-casterman團隊于1993年在駱駝血清中發現。單域抗體是單一的重鏈抗體的可變區結構域(variabledomain?of?heavychain?of?heavy?chain?antibody,vhh)，也即最小的活性抗原結合片段，分子量僅為傳統抗體的10％，直徑2.5nm。與傳統單克隆抗體相比，vhh抗體含有更大的cdr1和cdr3區，更便于識別微小隱藏表位和特殊結構。此外，vhh抗體還具有親和力強、免疫原性低、給藥方式多樣化、水溶性高、穩定性強、易于生產、易于偶聯和改造、生產成本低等優點，在診斷性抗體和治療性抗體上具有廣泛的應用前景。
技術實現思路
1、基于以上背景，本專利技術提供了一種能夠特異性結合人血栓調節蛋白的單域抗體及其應用。
2、在本專利技術的第一方面，提供了一種抗血栓調節蛋白單域抗體，所述單域抗體中的vhh鏈的互補決定區cdr區如下所示：seq?id?no:1所示的cdr1、seq?id?no:2所示的cdr2、和seq?id?no:3所示的cdr3。
3、在另一優選例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh鏈的框架區fr1、fr2、fr3和fr4所隔開；
4、在另一優選例中，所述vhh鏈還包括框架區fr，所述的框架區fr如下所示：seq?idno:4所示的fr1、seq?id?no:5所示的fr2、seq?id?no:6所示的fr3、seq?id?no:7所示的fr4；
5、在另一優選例中，所述的單域抗體vhh鏈的cdr區包含與seq?id?no:1-3具有至少80％、優選地至少90％、更優選地至少95％、甚至更優選地至少99％的序列相似性的氨基酸序列；
6、在另一優選例中，所述的單域抗體vhh鏈cdr區的氨基酸序列與seq?id?no:1-3相比包含一個或多個氨基酸取代，優選保守氨基酸取代；
7、在另一優選例中，上述氨基酸序列中任意一種氨基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個(如1-3個，較佳地1-2個，更佳地1個)氨基酸并能保留與血栓調節蛋白特異性結合能力的衍生序列；
8、在另一優選例中，所述抗血栓調節蛋白單域抗體具有如seq?id?no:8所示的氨基酸序列；
9、在另一優選例中，所述單域抗體能夠特異性結合血栓調節蛋白；
10、在另一優選例中，所述血栓調節蛋白為人的血栓調節蛋白。
11、本專利技術第二方面提供了一種抗血栓調節蛋白抗體，它是針對血栓調節蛋白的抗體，并且具有本專利技術第一方面所述的抗血栓調節蛋白單域抗體；
12、在另一優選例中，所述抗血栓調節蛋白抗體包括一個或多個抗血栓調節蛋白單域抗體；
13、在另一優選例中，所述抗血栓調節蛋白抗體包括單體、二價體(二價抗體)、四價體(四價抗體)、和/或多價體(多價抗體)；
14、在另一優選例中，所述抗血栓調節蛋白抗體包括一條或多條具有如seq?id?no:8所示的氨基酸序列的vhh鏈；
15、在另一優選例中，所述抗人血栓調節蛋白抗體具有如seq?id?no:8所示的氨基酸序列；
16、在另一優選例中，所述的抗體能夠特異性結合血栓調節蛋白。
17、本專利技術第三方面提供一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自下組的蛋白質：本專利技術第一方面所述抗人血栓調節蛋白單域抗體或本專利技術第二方面所述抗人血栓調節蛋白抗體；
18、在另一優選例中，所述多核苷酸為組合形式；
19、在另一優選例中，所述多核苷酸序列包含seq?id?no:9所示序列中的一種或多種；
20、在另一優選例中，所述多核苷酸包括dna或rna。
21、本專利技術第四方面提供了一種表達載體，所述表達載體含有本專利技術第三方面所述的多核苷酸；
22、在另一優選例中，所述的表達載體選自下組：dna、rna、病毒載體、質粒、轉座子、其他基因轉移系統、或其組合；
23、在另一優選例中，所述表達載體包括病毒載體，如慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆轉錄病毒。
24、本專利技術第五方面提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本專利技術第四方面所述的表達載體，或其基因組中整合有本專利技術第三方面所述的多核苷酸；
25、在另一優選例中，所述的宿主細胞包括原核細胞或真核細胞；
26、在另一優選例中，所述的宿主細胞選自下組：大腸桿菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、噬菌體、或其組合；
27、在另一優選例中，所述原本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種抗血栓調節蛋白單域抗體，其特征在于，所述單域抗體中的VHH鏈的互補決定區CDR如下所示：SEQ?ID?NO:1所示的CDR1、SEQ?ID?NO:2所示的CDR2、SEQ?ID?NO:3所示的CDR3。
2.根據權利要求1所述的抗血栓調節蛋白單域抗體，其特征在于，所述單域抗體的VHH鏈還包括框架區FR，所述的框架區FR如下所示：SEQ?ID?NO:4所示的FR1、SEQ?ID?NO:5所示的FR2、SEQ?ID?NO:6所示的FR3、SEQ?ID?NO:7所示的FR4。
3.一種抗血栓調節蛋白抗體，其特征在于，所述抗體包括一個或多個如權利要求1所述的抗血栓調節蛋白單域抗體。
4.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼選自下組的蛋白質：權利要求1所述的抗血栓調節蛋白單域抗體、權利要求3所述的抗血栓調節蛋白抗體。
5.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體含有權利要求4所述的多核苷酸。
6.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求5所述的表達載體，或其基因組中整合有權利要求4所述的多核苷酸。
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