【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及干細胞組織工程學，特別涉及一種利用水凝膠優化的細胞外囊泡及其制備方法和應用。
技術介紹
1、組織缺損由于創傷、感染、腫瘤切除等原因在臨床中較為常見，雖然損傷組織具有一定的自我再生能力，但其修復能力通常有限。隨著人口老齡化的加劇，組織再生所需的時間會進一步延長，且肥胖等因素也可能導致組織再生能力的下降。因此，促進組織修復與再生已成為一個重要的臨床問題。然而，目前臨床上用于促進組織再生的藥物常因價格昂貴或存在較大毒副作用而限制了其廣泛應用。
2、近年來的研究發現，組織再生過程受到多種細胞的調控，尤其是具有再生潛力的干細胞。干細胞通過釋放包含蛋白質、核酸類(如mirna)等生物分子的細胞外囊泡，發揮促進組織再生的作用。細胞外囊泡作為一種重要的細胞間通訊載體，能夠參與免疫調節、能量代謝、組織修復、新陳代謝等多個生物學過程。其天然的優勢使其成為潛在的藥物載體，較小的尺寸和雙層磷脂層結構有助于降低血管堵塞風險，且易于細胞攝取。此外，細胞外囊泡還具有較低的毒性和免疫原性，這些優點使其在組織再生領域成為一種理想的載體。
3、盡管細胞外囊泡作為藥物載體具有多項優勢，但其在促進組織再生方面的效果受限于其內含物的濃度和種類。目前常用的細胞外囊泡改造方法主要包括基因工程和化學裝載兩種途徑，但這些方法存在操作復雜、效率低下等問題。因此，開發一種簡單、高效的細胞外囊泡制備方法，以增強其促進組織再生的功能，成為當前研究的一個重要方向。
技術實現思路
1、針對現有技術中的缺陷
2、本專利技術提供了一種細胞外囊泡的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
3、(1)將干細胞以1×105～1×106個/cm2的密度置于纖維膜水凝膠上培養，收集培養液；
4、(2)將(1)所述培養液在500～1000g下離心5～10min，收集上清液，隨后在5000～10000g下離心20～40min，收集上清液，再使用0.22μm微孔濾膜除去雜質，得到所述細胞外囊泡；其中，在5000～10000g下的離心時間優選為30min。
5、其中，(1)所述纖維膜水凝膠包含凝膠劑，所述凝膠劑為5～20wt％甲基丙烯?；髂z和0.1～5wt％甲基丙烯酸酯化透明質酸的組合。明膠是膠原的降解產物，膠原和透明質酸為天然細胞外基質的化學組成部分，以明膠和透明質酸為培養基質，仿生天然細胞外基質的化學組份，模仿細胞天然的生存微環境，生長效果好。
6、在一些實施方式中，(1)所述纖維膜水凝膠的制備方法如下：
7、s1：將甲基丙烯?；髂z溶解于六氟異丙醇中，甲基丙烯酸酯化透明質酸溶解于三氟乙酸中，混合后配制含5～20wt％甲基丙烯?；髂z和0.1～5wt％甲基丙烯酸酯化透明質酸的紡絲溶液；
8、s2：將s1所述紡絲溶液使用靜電紡絲設備紡絲得到靜電紡絲膜；
9、s3：將s2所述靜電紡絲膜置于光引發劑溶液中，200～365nm的紫外線下暴露5～60min，隨后除去多余的光引發劑，得到所述纖維膜水凝膠。
10、靜電紡絲可以有效地將高分子溶液轉化為具有高比表面積、獨特形態和纖維結構的材料，當水凝膠與靜電紡絲技術結合時，可以制備出具有高度可調的纖維結構的水凝膠，可以提供更大的表面積和更多的附著點，促進細胞與基質的結合，增強細胞的附著和增殖。
11、在一些實施方式中，s3所述光引發劑溶液中包含0.5～5wt％的2-羥基-2-甲基丙酮或2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
12、在一些實施方式中，s2所述靜電紡絲的參數包括：紡絲針頭與不銹鋼接收板之間施加的電壓為10～20kv、紡絲針頭與不銹鋼接收板之間的距離為10～20cm、紡絲的時間為5～30min。
13、在一些實施方式中，所述干細胞為人骨髓間充質干細胞、人脂肪間充質干細胞、人臍帶間充質干細胞、人臍帶血間充質干細胞、人胎盤間充質干細胞，人牙髓干細胞、人牙周膜干細胞、人毛囊干細胞和人羊膜間充質干細胞中的任意一種，優選為人骨髓間充質干細胞。
14、在一些實施方式中，所述細胞外囊泡為外泌體、微囊泡或囊小體。
15、本專利技術還提供一種細胞外囊泡，由所述的制備方法得到。
16、本專利技術還提供一種細胞外囊泡制劑，包含所述的細胞外囊泡。
17、本專利技術還提供一種提高細胞外囊泡的組織再生促進功能的方法，采用所述的纖維膜水凝膠培養干細胞，制得細胞外囊泡。
18、本專利技術還提供所述的制備方法在制備細胞外囊泡中的應用。
19、綜上，與現有技術相比，本專利技術達到了以下技術效果：
20、1、本專利技術將特殊制備的纖維膜水凝膠作為培養干細胞的基質，通過纖維形貌調控干細胞的生理活動，有效增強了細胞外囊泡促進組織再生的功能，且無需進行復雜的基因操作或化學負載，大大簡化了操作流程。
21、2、本專利技術的培養基質纖維膜水凝膠的制備簡單方便，無明顯有害物質的引入，在提高細胞外囊泡功能的同時保持了其天然的生物相容性和低免疫原性，降低潛在的副作用風險，為臨床應用提供了更加安全且高效的選擇。
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1.一種細胞外囊泡的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，(1)所述纖維膜水凝膠的制備方法如下：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，S3所述光引發劑溶液中包含0.5～5wt％的2-羥基-2-甲基丙酮或2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，S2所述靜電紡絲的參數包括：紡絲針頭與不銹鋼接收板之間施加的電壓為10～20kV、紡絲針頭與不銹鋼接收板之間的距離為10～20cm、紡絲的時間為5～30min。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述干細胞為人骨髓間充質干細胞、人脂肪間充質干細胞、人臍帶間充質干細胞、人臍帶血間充質干細胞、人胎盤間充質干細胞，人牙髓干細胞、人牙周膜干細胞、人毛囊干細胞和人羊膜間充質干細胞中的任意一種。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述細胞外囊泡為外泌體、微囊泡或囊小體。
7.一種細胞外囊泡，其特征在于，由權利要求1～6任一項所述的制備方
8.一種細胞外囊泡制劑，其特征在于，包含權利要求7所述的細胞外囊泡。
9.一種提高細胞外囊泡的組織再生促進功能的方法，其特征在于，采用權利要求1中所述的纖維膜水凝膠培養干細胞，制得細胞外囊泡。
10.權利要求1～6任一項所述的制備方法在制備細胞外囊泡中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種細胞外囊泡的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，(1)所述纖維膜水凝膠的制備方法如下：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，s3所述光引發劑溶液中包含0.5～5wt％的2-羥基-2-甲基丙酮或2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，s2所述靜電紡絲的參數包括：紡絲針頭與不銹鋼接收板之間施加的電壓為10～20kv、紡絲針頭與不銹鋼接收板之間的距離為10～20cm、紡絲的時間為5～30min。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述干細胞為人骨髓間充質干...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙曉麗，邊少荃，郝瀏智，
申請(專利權)人：深圳先進技術研究院，
類型：發明
國別省市：
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