【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于蛋白檢測(cè)，具體涉及一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、臨床組織和液體樣本中的蛋白質(zhì)標(biāo)志物是反映疾病進(jìn)展程度的重要指標(biāo)。靈敏并準(zhǔn)確地檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)志物對(duì)于疾病管理中的及時(shí)干預(yù)和預(yù)后判斷至關(guān)重要。迄今為止，蛋白質(zhì)標(biāo)志物通常通過(guò)免疫組織化學(xué)（ihc）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）、和免疫印跡技術(shù)進(jìn)行分析和定量。然而，在成分復(fù)雜的真實(shí)臨床樣本中，受限于蛋白質(zhì)標(biāo)志物信號(hào)的高效放大，準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物仍是一大挑戰(zhàn)。同時(shí)，隨著健康管理需求的不斷增加，迫切需要開發(fā)真實(shí)樣本中蛋白質(zhì)標(biāo)志物的放大方法，以用于臨床疾病的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。
2、近十年來(lái)興起的crispr/cas系統(tǒng)因其對(duì)核酸的特異性識(shí)別和順式、反式裂解活性，被廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和小分子標(biāo)志物的檢測(cè)，為crispr/cas生物技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用打開了大門。盡管?crispr/cas系統(tǒng)具有多次翻轉(zhuǎn)的反式裂解特性，可以放大輸出信號(hào)，但目前基于?crispr?的檢測(cè)平臺(tái)仍需要與非等溫聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）和等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增（rpa）等前擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，才能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)靶核酸的高靈敏度和特異性。然而，對(duì)于非核酸標(biāo)記物（如蛋白質(zhì)標(biāo)志物），目前還沒(méi)有直接的預(yù)擴(kuò)增技術(shù)，阻礙了?crispr?系統(tǒng)在蛋白質(zhì)標(biāo)志物方面的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。因此，開發(fā)高效的蛋白質(zhì)標(biāo)志物預(yù)擴(kuò)增技術(shù)，并與?crispr/cas系統(tǒng)耦合，對(duì)于在成分復(fù)雜的真實(shí)臨床樣本中靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)志物至關(guān)重要。
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1、本專利技術(shù)的目的之一是為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)（dnf-crispr），該檢測(cè)平臺(tái)通過(guò)利用dna納米花對(duì)蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)進(jìn)行上游放大（高效的實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)標(biāo)志物的預(yù)擴(kuò)增技術(shù)），再利用crispr系統(tǒng)對(duì)輸出信號(hào)進(jìn)行下游放大，從而實(shí)現(xiàn)生物信號(hào)輸入和輸出級(jí)聯(lián)放大，通過(guò)這種上、下游級(jí)聯(lián)放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白標(biāo)志物超靈敏、高特異性檢測(cè)，是一個(gè)通用性的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)，在醫(yī)學(xué)診斷和食品安全等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。
2、本專利技術(shù)的目的之二是提供上述的一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法。
3、本專利技術(shù)的目的之三是提供上述的一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)的在蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用方法，通過(guò)該應(yīng)用方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白標(biāo)志物超靈敏、高特異性檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)500?fg/ml。
4、本專利技術(shù)的技術(shù)原理
5、根據(jù)蛋白標(biāo)志物設(shè)計(jì)dna納米花上成千上百的核酸能夠被cas-crrna復(fù)合物識(shí)別并激活cas蛋白順式和反式切割活性，對(duì)dnf進(jìn)行順式切割，同時(shí)對(duì)兩端分別標(biāo)記熒光猝滅對(duì)的報(bào)告鏈進(jìn)行反式切割，釋放熒光信號(hào)。
6、本專利技術(shù)的技術(shù)方案
7、一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)，包括利用dna納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊，和利用crispr系統(tǒng)放大蛋白標(biāo)志物輸出信號(hào)的下游模塊；
8、上述的利用dna納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊包括：抗體對(duì)、單鏈dna、偶聯(lián)劑、用于制備具有重復(fù)的擴(kuò)增鏈的dna納米花的模板鏈和引物鏈；
9、所述抗體對(duì)為蛋白標(biāo)志物的捕獲抗體和檢測(cè)抗體；
10、所述單鏈dna的序列為seq?id?no.1；
11、所述dna納米花上的擴(kuò)增鏈序列為seq?id?no.2；
12、所述引物鏈的序列為seq?id?no.3；
13、所述模板鏈的序列為seq?id?no.4；
14、所述偶聯(lián)劑為sulfo-smcc；
15、上述的利用crispr系統(tǒng)放大輸出信號(hào)的下游模塊包括：crrna、cas蛋白、兩端分別修飾熒光和猝滅基團(tuán)的報(bào)告鏈；
16、所述crrna的序列為seq?id?no.5；
17、所述報(bào)告鏈的序列為tttttt；
18、優(yōu)選的，所述的利用dna納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊中，還包括用于dna納米花制備所用的t4?dna連接酶、equiphi29?dna聚合酶、dntp、dtt、equiphi29緩沖液；
19、優(yōu)選的，利用crispr系統(tǒng)放大輸出信號(hào)的下游模塊中，所述的cas蛋白為cas12a或cas14；
20、所述的兩端分別修飾熒光和猝滅基團(tuán)的報(bào)告鏈中，熒光基團(tuán)為熒光基團(tuán)為5-羧基熒光素（fam）、花青素3（cy3）或花青素5（cy5），猝滅基團(tuán)為黑孔猝滅劑1（bhq1）、黑孔猝滅劑2（bhq2）或黑孔猝滅劑3（bhq3）。
21、一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
22、（1）、基于dna納米花對(duì)蛋白標(biāo)志物的輸入信號(hào)進(jìn)行放大的上游模塊，包括如下構(gòu)建步驟：
23、①、根據(jù)需要檢測(cè)的蛋白標(biāo)志物，選擇特異性結(jié)合的抗體對(duì)（捕獲抗體和檢測(cè)抗體）；其中捕獲抗體用于包被微孔板，對(duì)蛋白標(biāo)志物進(jìn)行特異性捕獲結(jié)合；其中檢測(cè)抗體通過(guò)偶聯(lián)劑與單鏈dna偶聯(lián)形成抗體-dna偶聯(lián)物（ab-oligo）；
24、所述單鏈dna的序列為seq?id?no.1；
25、所述偶聯(lián)劑為sulfo-smcc；
26、所述捕獲抗體包被濃度為8?μg/ml，4℃下過(guò)夜包被；
27、所述檢測(cè)抗體與sulfo-smcc偶聯(lián)劑的摩爾濃度比為1:100，反應(yīng)濃度為6?μg/ml，在4℃下反應(yīng)30min，與單鏈dna的摩爾濃度比為1:4，在37℃下反應(yīng)4h；
28、②、設(shè)計(jì)能夠與單鏈dna雜交互補(bǔ)的擴(kuò)增鏈及對(duì)應(yīng)的引物鏈和模板鏈。模板鏈和引物鏈在equiphi29?dna?聚合酶作用下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，生成具有重復(fù)擴(kuò)增鏈序列的dna納米花，合成的dna納米花作為上游模塊；
29、dna納米花上的擴(kuò)增鏈序列為seq?id?no.2；
30、所述引物鏈的序列為seq?id?no.3；
31、所述模板鏈的序列為seq?id?no.4；
32、所述滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)時(shí)間為2-6h，反應(yīng)溫度為37-42℃，equiphi29?dna聚合酶工作濃度為10?u?/μl；
33、所述滾環(huán)擴(kuò)增終止后，反應(yīng)液10000?rpm離心4min，保留下層沉淀，在milli-q水中重懸，重復(fù)3次后獲得dna納米花，將dna納米花分散于milli-q水中，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
34、上述所得的dna納米花呈球形花狀形態(tài)，直徑約200-800nm，優(yōu)選為200-650?nm；
35、③、抗體-dna偶聯(lián)物的抗體檢測(cè)到目標(biāo)蛋白后，另一端單鏈dna與dna納米花雜交（雜交序列為：seq?id?no.1與seq?id?no.2雜交），從而將蛋白生物信號(hào)轉(zhuǎn)化成dna納米花上重復(fù)擴(kuò)增鏈信號(hào)，實(shí)現(xiàn)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于，所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)，包括利用DNA納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊，和利用CRISPR系統(tǒng)放大蛋白標(biāo)志物輸出信號(hào)的下游模塊；
2.如權(quán)利要求1所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于，所述的利用DNA納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊中，還包括用于DNA納米花制備所用的T4?DNA連接酶、EquiPhi29?DNA聚合酶、dNTP、DTT、EquiPhi29緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于：
4.權(quán)利要求1、2或3所述的一種基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下構(gòu)建步驟：
5.如權(quán)利要求4所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）所述DNA納米花是在EquiPhi29?DNA?聚合酶作用下發(fā)生
6.如權(quán)利要求4所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）所述DNA納米花為滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)物理機(jī)械破壞、反復(fù)洗滌離心重懸所得。
7.如權(quán)利要求4所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）所述DNA納米花呈球形花狀形態(tài)，直徑約200-800?nm。
8.權(quán)利要求1、2或3所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)在蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)在蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，所得的DNA納米花作為輸入信號(hào)放大的上游模塊，Cas-crRNA復(fù)合物并將其作為下游模塊。
10.如權(quán)利要求9所述的基于DNA納米花級(jí)聯(lián)CRISPR系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)在蛋白標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，所述的Cas12a-crRNA復(fù)合物被蛋白標(biāo)志物對(duì)應(yīng)的DNA納米花激活后，反式切割報(bào)告鏈，利用這種級(jí)聯(lián)放大原理實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于，所述的基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)，包括利用dna納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊，和利用crispr系統(tǒng)放大蛋白標(biāo)志物輸出信號(hào)的下游模塊；
2.如權(quán)利要求1所述的基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于，所述的利用dna納米花放大蛋白標(biāo)志物輸入信號(hào)的上游模塊中，還包括用于dna納米花制備所用的t4?dna連接酶、equiphi29?dna聚合酶、dntp、dtt、equiphi29緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于：
4.權(quán)利要求1、2或3所述的一種基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下構(gòu)建步驟：
5.如權(quán)利要求4所述的基于dna納米花級(jí)聯(lián)crispr系統(tǒng)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）所述dna納米花是在equiphi29?dna?聚合酶作用下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)形成，反應(yīng)時(shí)間為2-6小時(shí)，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉培峰，李鳳琴，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海市腫瘤研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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