【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶、制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus)是一種革蘭氏陽(yáng)性致病菌，能引起許多疾病，甚至危及生命。其中，食源性金黃色葡萄球菌會(huì)引起食物中毒和感染，使人產(chǎn)生嘔吐或腹瀉的癥狀。在食品制備和加工過(guò)程中，食源性金黃色葡萄球菌會(huì)污染食品，常見于肉類和肉制品、牛奶和乳制品中。
2、青霉素的出現(xiàn)使得由金黃色葡萄球菌引起的傳染病在當(dāng)時(shí)得到了較好的控制，但隨著青霉素的廣泛使用，臨床上出現(xiàn)了耐青霉素的金黃色葡萄球菌。此后雖然有新的抗生素類藥物出現(xiàn)，但由于抗生素的廣泛使用，使細(xì)菌耐藥性危機(jī)不斷升級(jí)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistants.aureus,mrsa)、耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌，以及多重耐藥金黃色葡萄球菌，對(duì)公眾健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此，研究開發(fā)新型抗菌劑以對(duì)抗金黃色葡萄球菌造成的感染十分必要。
3、噬菌體裂解酶以其高效、安全、不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性且結(jié)構(gòu)易于改造等優(yōu)點(diǎn)成為了有潛力的抗菌藥物。大多數(shù)感染金黃色葡萄球菌噬菌體的裂解酶由酶活性結(jié)構(gòu)域(enzymatic?activity?domain,ead)和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cell?wall?binding?domain,cbd)兩部分組成。ead由n端的肽內(nèi)切酶，即半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶(cysteine-,histidine-dependent?amidohydrolase/peptida
4、目前對(duì)金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的研究主要集中于適應(yīng)中性或弱酸性環(huán)境的裂解酶，且大多數(shù)都為天然裂解酶，裂解活性不高，對(duì)于高效耐堿性裂解酶的研究較少。因此，通過(guò)重組結(jié)構(gòu)域的方法開發(fā)出耐受堿性環(huán)境、高裂解活性的裂解酶已成為本領(lǐng)域亟待解決的難題。
5、因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種新型的耐受堿性環(huán)境、高裂解活性的細(xì)菌裂解酶。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新型的耐受堿性環(huán)境、高裂解活性的細(xì)菌裂解酶。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供了一種耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶，其特征在于，所述裂解酶為salcd，氨基酸序列如seq?id?no.1所示，核苷酸序列如seq?idno.2所示。
3、本專利技術(shù)還提供前述的耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
4、步驟1、對(duì)chap結(jié)構(gòu)域與cbd結(jié)構(gòu)域分別設(shè)計(jì)引物以人工合成的序列seq?id?no.2為模版進(jìn)行擴(kuò)增，獲得salcd-chap、salcd-cbd基因片段，salcd-chap、salcd-cbd基因片段的序列分別如seq?id?no.7、seq?id?no.8所示；
5、步驟2、按照n端為chap結(jié)構(gòu)域，c端為cbd結(jié)構(gòu)域的順序?qū)⒉襟E1中的基因片段克隆至表達(dá)質(zhì)粒中，獲得含有salcd的表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株中；
6、步驟3、對(duì)步驟2中獲得的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化，獲得刪除酰胺酶結(jié)構(gòu)域的截短裂解酶salcd。
7、在本專利技術(shù)的較佳實(shí)施方式中，所述步驟1中的引物序列如下：
8、seq?id?no.3
9、sal-chap-f:ctttaagaaggagatataccatggctaagactcaagcagaa；
10、seq?id?no.4
11、sal-chap-r:ttttccaagaattcttagaaacttttagtgttgct；
12、seq?id?no.5
13、sal-cbd-f:ttctaagaattcttggaaaaagaaccagtac；
14、seq?id?no.6
15、sal-cbd-r:cagtggtggtggtggtggtgtttgaatactccccaggc。
16、在本專利技術(shù)的另一較佳實(shí)施方式中，所述步驟2和步驟3具體包括：
17、步驟2.1、將步驟1中獲得的基因片段與經(jīng)ncoⅰ和xhoⅰ雙酶切后的pet28a質(zhì)粒進(jìn)行切膠回收，將基因片段與質(zhì)粒加入無(wú)縫克隆體系反應(yīng)；
18、步驟2.2、將無(wú)縫克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入e.coli?dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布在含有卡那霉素的lb平板上培養(yǎng)后，接種至含卡那霉素的lb肉湯中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即salcd的重組表達(dá)質(zhì)粒；
19、步驟2.3、將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入e.coli?bl21感受態(tài)中，將菌液涂布在含卡那霉素的lb平板上培養(yǎng)后，接種至含卡那霉素的lb肉湯中培養(yǎng)，并保藏菌液；
20、步驟3.1、活化培養(yǎng)步驟2.3中獲得的菌株，隨后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，加入iptg誘導(dǎo)表達(dá)；
21、步驟3.2、離心收集菌體，洗滌后，按比例加入裂解液裂解，待菌液澄清透明后離心，分離上清沉淀；
22、步驟3.3、使用濾膜過(guò)濾細(xì)菌破碎上清液，以此為樣品，使用ni-nta預(yù)裝重力柱進(jìn)行裂解酶純化，在每一步驟中控制柱中存在的液體體積一致，保證壓力一致，液體流速一致，對(duì)樣品流穿液、流洗液、洗脫液進(jìn)行sds-page檢測(cè)，確定目的蛋白有單一條帶的洗脫濃度，收集該濃度洗脫液進(jìn)行超濾濃縮后，置于-80℃凍存。
23、本專利技術(shù)還提供上述耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶的應(yīng)用。
24、在本專利技術(shù)的較佳實(shí)施方式中，所述裂解酶在ph?8.0-11.0下使用。
25、在本專利技術(shù)的另一較佳實(shí)施方式中，所述裂解酶在室溫下使用。
26、在本專利技術(shù)的另一較佳實(shí)施方式中，所述裂解酶用于控制多種金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌，所述其他葡萄球菌包括頭葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、小牛肉葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
27、在本專利技術(shù)的另一較佳實(shí)施方式中，所述裂解酶在有活性輔助因子時(shí)使用，所述活性輔助因子為ca2+或mg2+。
28、在本專利技術(shù)的另一較佳實(shí)施方式中，所述裂解酶應(yīng)用于食品加工行業(yè)，作為噴劑直接使用，或通過(guò)ph敏感的脂質(zhì)體封裝在堿性環(huán)境下觸發(fā)釋放。
29、技術(shù)效果
30、1、本專利技術(shù)提供的一種高效耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量為32.2kd。
31、2、本專利技術(shù)通過(guò)結(jié)構(gòu)域重組改變裂解酶的性質(zhì)，使得salcd的堿性環(huán)境耐受性更強(qiáng)，最適ph為11.0，且保持高活性的范圍較廣，在ph?9.0-11.0的環(huán)境下相對(duì)活性在80％以上，salcd可以應(yīng)用于堿性環(huán)境中，如食品加工行業(yè)中，可作為噴劑直接使用，或通過(guò)ph敏感的脂質(zhì)體封裝在堿性環(huán)境下觸發(fā)釋放；本專利技術(shù)提供的高效耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶，其特征在于，所述裂解酶為SALcd，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟1中的引物序列如下：
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2和步驟3具體包括：
5.如權(quán)利要求1所述耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裂解酶在pH?8.0-11.0下使用。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裂解酶在室溫下使用。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裂解酶用于控制多種金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌，所述其他葡萄球菌包括頭葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、小牛肉葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裂解酶在有活性輔助因子時(shí)使用，所述活性輔助因子為Ca2
10.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述裂解酶應(yīng)用于食品加工行業(yè)，作為噴劑直接使用，或通過(guò)pH敏感的脂質(zhì)體封裝在堿性環(huán)境下觸發(fā)釋放。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶，其特征在于，所述裂解酶為salcd，氨基酸序列如seq?id?no.1所示，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟1中的引物序列如下：
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2和步驟3具體包括：
5.如權(quán)利要求1所述耐堿性金黃色葡萄球菌噬菌體重組裂解酶的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：施春雷，王水婷，張?jiān)龇?/a>，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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