【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)屬于基因工程，具體涉及一種葡萄糖氧化酶突變體及其制備方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、葡萄糖氧化酶(glucose?oxidase,e.c.1.1.3.4，god)在有氧條件下能專一性地催化β-d-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶是同型二聚體分子，含有2個黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)結(jié)合位點(diǎn)。每個單體含有2個完全不同的區(qū)域：一個區(qū)域主要由β-折疊組成，以非共價鍵與黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)輔酶分子緊密結(jié)合；另一個區(qū)域則由4個α-螺旋支撐1個反平行的β-折疊組成，可與底物β-d-葡萄糖結(jié)合。該酶能將β-d-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯與過氧化氫，其中葡萄糖酸內(nèi)酯能夠在非酶促反應(yīng)下轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸。
2、葡萄糖酸是一種溫和、無腐蝕、無毒、易于生物降解的有機(jī)酸，由葡萄糖的微生物氧化產(chǎn)生。其化學(xué)和生理特性使葡萄糖酸及其鹽，特別是葡萄糖酸鈉，在化學(xué)、紡織、飲料、制藥(如缺鐵和缺鈣)、建筑和食品工業(yè)中具有重要作用。根據(jù)市場研究報告，2020年全球葡萄糖酸市場價值約為10億美元，預(yù)計到2028年將達(dá)到19億美元，在2021年至2028年期間以5％的復(fù)合年增長率增長。化學(xué)和發(fā)酵工藝是生產(chǎn)葡萄糖酸的主要技術(shù)。盡管通過化學(xué)和電解氧化一步轉(zhuǎn)化合成葡萄糖酸是有效的，但高電解成本、環(huán)境毒性和生物危害限制了化學(xué)方法的工業(yè)應(yīng)用。目前的工業(yè)工藝是基于以葡萄糖為底物的黑曲霉的發(fā)酵工藝，也有采用葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶共催化生產(chǎn)葡萄糖酸鹽。雙酶法產(chǎn)葡萄糖酸鈉采用葡萄糖為主要原料，葡萄糖氧化酶在過氧化氫酶的協(xié)同作用下將葡萄糖直接轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸
3、然而，現(xiàn)有葡萄糖氧化酶的耐熱性能仍較差，難以滿足生產(chǎn)前的滅菌需求，耐熱性能的問題制約了雙酶法生產(chǎn)的應(yīng)用。基于此，希望提出一種耐熱性能良好的葡萄糖氧化酶，以用于工業(yè)生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題。為此，本專利技術(shù)提出一種葡萄糖氧化酶突變體及其制備方法與應(yīng)用。相較于親本葡萄糖氧化酶，該葡萄糖氧化酶突變體的熱穩(wěn)定性得到明顯提升，體現(xiàn)出較好的耐熱性，有利于葡萄糖酸鹽的生產(chǎn)應(yīng)用。
2、本專利技術(shù)提供了一種葡萄糖氧化酶突變體，所述葡萄糖氧化酶突變體相對于來源于黑曲霉(aspergillus?niger)親本葡萄糖氧化酶(其氨基酸序列如seq?id?no：1所示)，具有至少98％且小于100％的序列一致性，且包括二硫鍵突變位點(diǎn)k37c+a572c。
3、其中，k37c+a572c的含義為在親本葡萄糖氧化酶的第37位與第572位氨基酸殘基用半胱氨酸進(jìn)行的取代，并形成二硫鍵。
4、seq?id?no：1：sngieasllkdpklvagrtydyiiaggglagltvaeklt?enpnitvlviesgsyesdrgpiiedlnaygeifgtsvdhayetvelatnnrtalirsgnglggstlinggtwtrphkaqvdswetvfgnegwnwdsvaayslqaerarapnakqiaaghyfnaschglngtvhvgprdtgddysplmralmsavedrgvptkkdlgcgdphgvsmfpntlhedqvradaarewllpnyqrpnlqv?ltgqyvgkvllsqnattpravgvefgthksnthnvyakhevllsagstvsptileysgigmksileplgidtvvdlpvglnlqdqttstvrsritsagagqgqaawfatfnetfgdytekahellntkleqwaeeavarggfhnttalliqyenyrdwivkdnvayselfldtggvasfdvwdllpftrgyvhildkdpylrhfaydpqyflneldllgqaaatqlarnisnsgamqtyfagetipgdnlaydadlsawveyipehfrpnyhgvgtcsmmpkemggvvdnaarvygvqglrvidgsipptqlsshvmtvfyamalkiadavladyasmq。
5、優(yōu)選地，在本專利技術(shù)的一些實(shí)施例中，還包含二硫鍵突變位點(diǎn)s53c+t246c或s191c+a479c。
6、其中，s53c+t246c的含義為在親本葡萄糖氧化酶的第53位與第246位氨基酸殘基用半胱氨酸進(jìn)行的取代，且第53位與第246位也形成二硫鍵；s191c+a479c的含義為在親本葡萄糖氧化酶的第191位與第479位氨基酸殘基用半胱氨酸進(jìn)行的取代，且第191位與第479位也形成二硫鍵。
7、試驗(yàn)表明，相較于親本葡萄糖氧化酶，本專利技術(shù)包含二硫鍵突變位點(diǎn)的葡萄糖氧化酶突變體在耐高溫穩(wěn)定性和耐熱性能得到顯著提升，可應(yīng)用于葡萄糖酸鹽的生產(chǎn)，具有優(yōu)異的效果。
8、本專利技術(shù)還提供了一種核酸分子，包含(a)和/或(b)所示的核苷酸片段：
9、(a)編碼上述葡萄糖氧化酶突變體的核苷酸片段；
10、(b)與(a)反向互補(bǔ)的核苷酸片段。
11、本專利技術(shù)還提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述核酸分子。
12、本專利技術(shù)還提供了一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含上述核酸分子或上述重組表達(dá)載體。
13、優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞包括細(xì)菌或真菌細(xì)胞。
14、更優(yōu)選地，所述真菌細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。
15、本專利技術(shù)還提供上述葡萄糖氧化酶突變體的制備方法，包括以下步驟：
16、(1)培養(yǎng)重組細(xì)胞；
17、(2)誘導(dǎo)所述重組細(xì)胞表達(dá)上述葡萄糖氧化酶突變體。
18、本專利技術(shù)還提供了上述葡萄糖氧化酶突變體在生產(chǎn)葡萄糖酸鹽中的應(yīng)用。
19、相比現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的有益效果在于：
20、本專利技術(shù)提供的葡萄糖氧化酶突變體，與seq?id?no：1所示氨基酸序列的親本葡萄糖氧化酶相比，其耐高溫穩(wěn)定性和耐熱性能得到顯著提升。同時，本專利技術(shù)提供的葡萄糖氧化酶突變體在葡萄糖酸鹽的生產(chǎn)中具有更優(yōu)異的效果，表現(xiàn)為反應(yīng)速率更快且反應(yīng)更為徹底。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶突變體相對于SEQ?IDNO：1所示氨基酸序列的親本葡萄糖氧化酶，具有至少98％且小于100％的序列一致性，且包括二硫鍵突變位點(diǎn)K37C+A572C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，還包括二硫鍵突變位點(diǎn)S53C+T246C或S191C+A479C。
3.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含(a)和/或(b)所示的核苷酸片段：
4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求3所述的核酸分子。
5.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞包含權(quán)利要求3所述的核酸分子或權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞包括細(xì)菌或真菌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述真菌細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖氧化酶突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖氧化酶突變體在生產(chǎn)葡萄糖酸鹽
...【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
1.一種葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶突變體相對于seq?idno：1所示氨基酸序列的親本葡萄糖氧化酶，具有至少98％且小于100％的序列一致性，且包括二硫鍵突變位點(diǎn)k37c+a572c。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，還包括二硫鍵突變位點(diǎn)s53c+t246c或s191c+a479c。
3.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含(a)和/或(b)所示的核苷酸片段：
4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃江，李陽源，張智良，邊葉雨，周爽姿，何小梅，黃佳樂，陳瓊銀，賀金玲，江民華，
申請(專利權(quán))人：廣東溢多利生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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