【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、隨著tcr-t細(xì)胞療法發(fā)展成為實(shí)體瘤有前景的治療方案，但其開(kāi)發(fā)仍面臨諸多障礙，包括抑制性腫瘤免疫微環(huán)境所致的高耐藥性，t細(xì)胞功能性不足等(klebanoff?et?al.,2016；sadelain?et?al.,2017)。此外，t細(xì)胞體外工程化制造面臨巨大投資和低產(chǎn)量高失敗率的問(wèn)題。當(dāng)前研究致力聯(lián)合其他藥物以提高工程化t細(xì)胞效力，如聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑和新抗原腫瘤疫苗(li?et?al.,2022；srivastava?et?al.,2021；wiede?et?al.,2022；puig-saus?et?al.,2023；reinhard?et?al.,2020),聯(lián)合溶瘤病毒等改善t細(xì)胞歸巢(chalise?et?al.,2022；evgin?et?al.,2022；rezaei?etal.,2022；wang?et?al.,2023)等進(jìn)一步增強(qiáng)t細(xì)胞治療潛力。然而，即使是聯(lián)合其他藥物，往往也面臨免疫循環(huán)的激活失敗，其最終的腫瘤治療效果仍不理想。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的有效的抗腫瘤藥物以協(xié)同增強(qiáng)t細(xì)胞療效。
2、盡管基于t細(xì)胞的免疫療法具有多種作用機(jī)制，但其最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞凋亡。凋亡是一類(lèi)經(jīng)典的細(xì)胞程序性死亡方式。作為誘導(dǎo)凋亡的最小單元，促凋亡bh3結(jié)構(gòu)域被視為癌癥免疫治療的有效靶點(diǎn)(hossini?and?eberle,2008；kelekar?and?thompson,1998)。僅含有bh3結(jié)構(gòu)域的亞家族，如bim
3、mrna作為一種可代替dna與重組蛋白的全新藥物形式，其表達(dá)可控，安全性高，在癌癥免疫治療領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。編碼促凋亡bh3結(jié)構(gòu)域的mrna藥物可用于啟動(dòng)病灶局部癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)協(xié)同增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。綜上，由于現(xiàn)有t細(xì)胞療法在腫瘤治療中的效果受限，開(kāi)發(fā)一種用于增強(qiáng)t細(xì)胞療效的抗腫瘤mrna藥物是非常有意義的，可大幅減少t細(xì)胞療法所需t細(xì)胞數(shù)量與經(jīng)濟(jì)成本，為臨床提供一種安全、高效、經(jīng)濟(jì)的mrna藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的是為解決目前單獨(dú)使用t細(xì)胞療法的治療能力有限、所需t細(xì)胞數(shù)量多免疫原性高的問(wèn)題，提供一種增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物與應(yīng)用，具有提高單一t細(xì)胞療法抗腫瘤活性的作用。
2、本專(zhuān)利技術(shù)的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
3、第一方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物，所述mrna藥物包括藥用載體和活性成分，所述活性成分包括5'端到3'端編碼序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示的mrna分子，用于編碼融合適配體支架的促凋亡蛋白puma或bim的bh3結(jié)構(gòu)域，所述mrna藥物為瘤內(nèi)局部給藥劑型。
4、所述mrna分子包括兩個(gè)部分，分別為促凋亡蛋白家族puma或bim?bh3結(jié)構(gòu)域序列，編碼序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。stefin?a四重適配體支架序列，編碼序列如seq?id?no.3所示。
5、作為優(yōu)選，所述適配體支架為stefin?a四重適配體支架，編碼序列如seq?id?no.3所示。
6、作為優(yōu)選，所述mrna分子具有加帽修飾。所述mrna分子5’端具有一個(gè)m7g-pppnm結(jié)構(gòu)。
7、本專(zhuān)利技術(shù)中所述mrna藥物為瘤內(nèi)局部給藥劑型，通過(guò)瘤內(nèi)局部給藥的方式，所述mrna分子被腫瘤細(xì)胞攝取并得以表達(dá)，實(shí)現(xiàn)局部表達(dá)。研究表明，該給藥方式具備生物安全性。本專(zhuān)利技術(shù)提供的mrna分子不易進(jìn)入全身循環(huán)，毒性較低。
8、作為優(yōu)選，所述藥用載體為脂質(zhì)納米顆粒(lnp)，所述mrna分子封裝于所述脂質(zhì)納米顆粒中。研究表明，利用脂質(zhì)納米顆粒作為mrna分子遞送載體有助于提高mrna分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)效率。
9、作為優(yōu)選，本專(zhuān)利技術(shù)提供的抗腫瘤mrna疫苗應(yīng)用時(shí)，應(yīng)多次間隔給藥。作為優(yōu)選，給藥間隔時(shí)間為2天，給藥次數(shù)為3次。
10、第二方面，本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種所述的增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物的制備方法，包括以下步驟：
11、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增分別獲得編碼促凋亡蛋白家族puma或bim?bh3結(jié)構(gòu)域、stefin?a四重適配體支架的dna片段，以此為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)添加同源臂進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，獲得融合基因；再將融合基因連入mrna體外轉(zhuǎn)錄載體中得到重組質(zhì)粒，酶切后獲得體外轉(zhuǎn)錄線(xiàn)性化模板；然后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、修飾及純化制得所述mrna分子；最后將mrna分子裝載于藥用載體上制得mrna藥物。
12、所述mrna藥物均為獨(dú)立包裝。
13、作為優(yōu)選，利用脂質(zhì)納米顆粒lnp封裝mrna分子，其制備過(guò)程包括：將mrna分子稀釋于ph為4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入脂質(zhì)乙醇溶液混勻，反復(fù)吹打，透析制得負(fù)載mrna的脂質(zhì)納米顆粒；所述脂質(zhì)乙醇溶液中含有sm102、dspc、cho-hp和peg2000，摩爾比為50：10：38.5：1.5。
14、第三方面，本專(zhuān)利技術(shù)還提供了所述的mrna藥物在制備腫瘤治療藥物以及協(xié)同提升t細(xì)胞療效中的應(yīng)用。
15、所述腫瘤為實(shí)體瘤，至少包括：黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌。
16、本專(zhuān)利技術(shù)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用該mrna-lnp局部療法對(duì)黑色素瘤實(shí)體瘤模型腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用，并且可以協(xié)同提高t細(xì)胞療法的抗腫瘤效果。
17、本專(zhuān)利技術(shù)具備的有益效果：
18、本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種用于增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna抗腫瘤藥物。利用mrna藥物的形式進(jìn)行瘤內(nèi)局部給藥，誘導(dǎo)病灶局部細(xì)胞凋亡，同時(shí)協(xié)同增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)，最終達(dá)到在體內(nèi)協(xié)同抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用。本專(zhuān)利技術(shù)提供的mrna新型藥物在實(shí)體瘤模型中展現(xiàn)出強(qiáng)有效的抑瘤作用，其普適性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣，可大幅減少t細(xì)胞療法所需t細(xì)胞數(shù)量與成本，提供了一種安全、高效、經(jīng)濟(jì)的抗腫瘤藥物模式。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物，其特征在于，所述mRNA藥物包括藥用載體和活性成分，所述活性成分包括5'端到3'端編碼序列如SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示的mRNA分子，用于編碼融合適配體支架的促凋亡蛋白Puma或Bim的BH3結(jié)構(gòu)域，所述mRNA藥物為瘤內(nèi)局部給藥劑型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物，其特征在于，所述促凋亡蛋白家族Puma或Bim的BH3結(jié)構(gòu)域編碼序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示；適配體支架序列為Stefin?A四重適配體支架，編碼序列如SEQ?ID?NO.3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物，其特征在于，所述mRNA分子具有加帽修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物，其特征在于，所述藥用載體為脂質(zhì)納米顆粒，所述mRNA分子封裝于所述脂質(zhì)納米顆粒中。
5.一種如權(quán)利要求1所述增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增分別獲得編碼促凋亡蛋白家族Puma
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物的制備方法，其特征在于，所述將mRNA分子裝載于藥用載體上，包括：將mRNA分子稀釋于pH為4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入脂質(zhì)乙醇溶液混勻，反復(fù)吹打，透析制得負(fù)載mRNA的脂質(zhì)納米顆粒；所述脂質(zhì)乙醇溶液中含有SM102、DSPC、CHO-HP和PEG2000，摩爾比為50：10：38.5：1.5。
7.一種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述增強(qiáng)T細(xì)胞療效的mRNA藥物的用途，其特征在于，所述用途包括：(1)用于制備腫瘤治療藥物；(2)與T細(xì)胞聯(lián)合給藥，用于提升T細(xì)胞療效。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為實(shí)體瘤，至少包括：黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物，其特征在于，所述mrna藥物包括藥用載體和活性成分，所述活性成分包括5'端到3'端編碼序列如seq?id?no.4或seq?id?no.5所示的mrna分子，用于編碼融合適配體支架的促凋亡蛋白puma或bim的bh3結(jié)構(gòu)域，所述mrna藥物為瘤內(nèi)局部給藥劑型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物，其特征在于，所述促凋亡蛋白家族puma或bim的bh3結(jié)構(gòu)域編碼序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示；適配體支架序列為stefin?a四重適配體支架，編碼序列如seq?id?no.3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物，其特征在于，所述mrna分子具有加帽修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物，其特征在于，所述藥用載體為脂質(zhì)納米顆粒，所述mrna分子封裝于所述脂質(zhì)納米顆粒中。
5.一種如權(quán)利要求1所述增強(qiáng)t細(xì)胞療效的mrna藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增分別獲得編碼促凋亡蛋白家族p...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：金勇豐，傅佳燕，劉曜奇，冉璐娜，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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