【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物工程，尤其涉及一種基因工程菌及全細胞催化生產(chǎn)淫羊藿素的方法。
技術(shù)介紹
1、淫羊藿素（icaritin）是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的異戊烯基類黃酮衍生物，分子式為c21h22o7，分子量為386.4，來源于淫羊藿屬植物。具有廣泛的藥理活性，在治療心血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎、男性性功能障礙、炎癥、阿爾茲海默癥和癌癥中均表現(xiàn)出巨大的潛力。淫羊藿素軟膠囊（阿可拉定，icaritin）已于被中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)作為抗肝細胞癌藥物上市。
2、目前淫羊藿主要通過傳統(tǒng)人工栽培實現(xiàn)量產(chǎn)，存在生長周期長、繁殖困難、生長要求嚴(yán)格、含量低等問題，此外化學(xué)合成的方式面臨步驟復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、污染較大等挑戰(zhàn)。相比之下，生物法合成具備原料廉價、環(huán)境友好、工藝簡單等優(yōu)勢。
3、現(xiàn)階段淫羊藿素的生物合成法主要由酶催化水解淫羊藿苷獲得，由于黃酮-3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶以及氧甲基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達困難以及轉(zhuǎn)化率低等問題，目前難以在大腸桿菌中催化柚皮素生成淫羊藿素。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述在大腸桿菌中催化柚皮素生成淫羊藿素的技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種基因工程菌及全細胞催化生產(chǎn)淫羊藿素的方法。本專利技術(shù)通過構(gòu)建雙質(zhì)粒，使得在大腸桿菌中同時過表達膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶，從而構(gòu)建基因工程菌，將該工程菌作為全細胞催化劑，將柚皮素和3-甲基-2-丁烯-1-醇作為底物通過全細胞催化的方式轉(zhuǎn)化為淫羊藿素，只
2、本專利技術(shù)的具體技術(shù)方案為：
3、一方面，本專利技術(shù)提供了一種基因工程菌，其以大腸桿菌為底盤菌，在底盤菌中過表達來源于膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶得到。
4、本專利技術(shù)通過使在大腸桿菌中同時過表達膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶，從而構(gòu)建基因工程菌，將該工程菌作為全細胞催化劑，將柚皮素和3-甲基-2-丁烯-1-醇作為底物通過全細胞催化的方式轉(zhuǎn)化為淫羊藿素，只需一步反應(yīng)，簡單快捷，效率高，轉(zhuǎn)化的過程中不用額外添加其它化學(xué)物質(zhì)，降低了成本，減輕了對環(huán)境的污染，實現(xiàn)了從低價的柚皮素到高附加值淫羊藿素的生物法生產(chǎn)。
5、作為上述基因工程菌的優(yōu)選，所述過表達通過在底盤菌中導(dǎo)入質(zhì)粒pet-scck-atipk-tcf3h-(tptp)2-citfls和質(zhì)粒pacyc-st-(ggggs)2-espt2-mpomt4實現(xiàn)。
6、本專利技術(shù)通過構(gòu)建雙質(zhì)粒，使得在大腸桿菌中同時過表達膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶，從而構(gòu)建基因工程菌。
7、作為上述基因工程菌的優(yōu)選，所述質(zhì)粒pet-scck-atipk-tcf3h-(tptp)2-citfls為通過連接膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶和tcf3h-(tptp)2-citfls的編碼基因于載體petduet得到，所述tcf3h為來源于可可樹的黃酮3-羥化酶，所述citfls為來源于柑橘的黃酮醇合酶。
8、作為上述基因工程菌的優(yōu)選，所述質(zhì)粒pacyc-st-(ggggs)2-espt2-mpomt4為通過連接st-(ggggs)2-espt2和氧甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因于載體pacycduet得到，所述st-(ggggs)2-espt2為通過異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的n端氨基酸開始截短81個氨基酸、第152位蘇氨酸突變?yōu)樘於０贰⒃趎端用連接肽(ggggs)2連接可溶性標(biāo)簽st得到的基因片段。
9、進一步優(yōu)選，所述st為大腸桿菌來源trx。
10、進一步優(yōu)選，所述氧甲基轉(zhuǎn)移酶為通過將如seq?id?no.16所示的野生型氧甲基轉(zhuǎn)移酶的第135位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸、第142位氨基酸突變?yōu)槔野彼岷蟮玫健?/p>
11、另一方面，本專利技術(shù)提供了上述基因工程菌在發(fā)酵生成淫羊藿素中的應(yīng)用。
12、基于上述，本專利技術(shù)還提供了一種全細胞催化生產(chǎn)淫羊藿素的方法，其以柚皮素為反應(yīng)底物，以上述基因工程菌催化反應(yīng)得到淫羊藿素。
13、具體地，作為所述方法的優(yōu)選，將所述基因工程菌接種發(fā)酵1~10小時后，添加iptg誘導(dǎo)后，加入底物柚皮素和3-甲基-2-丁烯-1-醇，在25~30℃下，催化發(fā)酵24~48?小時。
14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下技術(shù)效果：
15、本專利技術(shù)通過構(gòu)建雙質(zhì)粒，使得在大腸桿菌中同時過表達膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶，從而構(gòu)建基因工程菌，將該工程菌作為全細胞催化劑，將柚皮素和3-甲基-2-丁烯-1-醇作為底物通過全細胞催化的方式轉(zhuǎn)化為淫羊藿素，只需一步反應(yīng)，簡單快捷，效率高，轉(zhuǎn)化的過程中不用額外添加其它化學(xué)物質(zhì)，降低了成本，減輕了對環(huán)境的污染，實現(xiàn)了從低價的柚皮素到高附加值淫羊藿素的生物法生產(chǎn)。
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1.一種基因工程菌，其特征在于：以大腸桿菌為底盤菌，在底盤菌中過表達來源于膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述過表達通過在底盤菌中導(dǎo)入質(zhì)粒pET-Scck-Atipk-TcF3H-(TPTP)2-CitFLS和質(zhì)粒pACYC-ST-(GGGGS)2-EsPT2-MpOMT4實現(xiàn)。
3.如權(quán)利要求2所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述質(zhì)粒pET-Scck-Atipk-TcF3H-(TPTP)2-CitFLS為通過連接膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶和TcF3H-(TPTP)2-CitFLS的編碼基因于載體pETDuet得到，所述TcF3H為來源于可可樹的黃酮3-羥化酶，所述CitFLS為來源于柑橘的黃酮醇合酶。
4.如權(quán)利要求2所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述質(zhì)粒pACYC-ST-(GGGGS)2-EsPT2-MpOMT4為通過連接ST-(GGGGS)2-EsPT2和氧甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因于載體pACYCDuet得到，所述ST-(GGGGS
5.如權(quán)利要求4所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述ST為大腸桿菌來源。
6.如權(quán)利要求4所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述氧甲基轉(zhuǎn)移酶為通過將如SEQ?ID?NO.16所示的野生型氧甲基轉(zhuǎn)移酶的第135位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸、第142位氨基酸突變?yōu)槔野彼岷蟮玫健?/p>
7.如權(quán)利要求1~6任一項所述的基因工程菌在發(fā)酵生成淫羊藿素中的應(yīng)用。
8.一種全細胞催化生產(chǎn)淫羊藿素的方法，其特征在于：以柚皮素為反應(yīng)底物，以權(quán)利要求1~6任一項所述的基因工程菌催化反應(yīng)得到淫羊藿素。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：將所述基因工程菌接種發(fā)酵1~10小時后，添加IPTG誘導(dǎo)后，加入底物柚皮素和3-甲基-2-丁烯-1-醇，在25~30℃下，催化發(fā)酵24~48?小時。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基因工程菌，其特征在于：以大腸桿菌為底盤菌，在底盤菌中過表達來源于膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶、黃酮3-羥化酶、黃酮醇合酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和氧甲基轉(zhuǎn)移酶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述過表達通過在底盤菌中導(dǎo)入質(zhì)粒pet-scck-atipk-tcf3h-(tptp)2-citfls和質(zhì)粒pacyc-st-(ggggs)2-espt2-mpomt4實現(xiàn)。
3.如權(quán)利要求2所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述質(zhì)粒pet-scck-atipk-tcf3h-(tptp)2-citfls為通過連接膽堿激酶、異戊烯基磷酸激酶和tcf3h-(tptp)2-citfls的編碼基因于載體petduet得到，所述tcf3h為來源于可可樹的黃酮3-羥化酶，所述citfls為來源于柑橘的黃酮醇合酶。
4.如權(quán)利要求2所述的一種基因工程菌，其特征在于：所述質(zhì)粒pacyc-st-(ggggs)2-espt2-mpomt4為通過連接st-(ggggs)2-espt2和氧甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柳志強，吳安怡，周俊平，劉云，逄愛萍，鄭裕國，
申請(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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