【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及組織工程和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與商業(yè)化孔板結(jié)合的肝臟類器官芯片用于抗纖維化活性成分高通量篩選及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、肝臟作為人體代謝重要而復(fù)雜的器官，參與蛋白質(zhì)及脂肪的代謝、膽汁制造、解毒、免疫調(diào)節(jié)等功能。肝纖維化是肝臟對損傷的反應(yīng)，主要特征是肝臟結(jié)締組織的過度增生，通常由慢性肝病引起，包括非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等。肝纖維化的發(fā)生與肥胖、高血壓、胰島素抵抗等代謝異常密切相關(guān)，且如果不及時干預(yù)，可能進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。近年來，司美格魯肽作為一種備受關(guān)注的減肥藥物，在治療非酒精性脂肪肝及肝纖維化等疾病方面也引起了廣泛關(guān)注。雖然動物試驗對司美格魯肽的作用效果取得一定進(jìn)展，但由于動物和人體之間存在的物種差異，無法完全預(yù)測人類對藥物的反應(yīng)。此外，藥物研發(fā)過程復(fù)雜且耗時，許多候選藥物在臨床試驗階段可能因療效不足或毒性等問題而未能上市。因此，亟需開發(fā)與人體高度相關(guān)的體外藥物測試平臺，以真實反應(yīng)人類相關(guān)的藥物反應(yīng)，探索如司美格魯肽藥物或其它已上市的藥物或先導(dǎo)化合物在非酒精性脂肪肝相關(guān)的肝纖維化中的潛在療效，以期加速藥物發(fā)現(xiàn)，縮短創(chuàng)新藥物臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。
2、類器官芯片作為一種新興的創(chuàng)新技術(shù)，通過結(jié)合自組裝類器官和器官芯片來構(gòu)建生理相關(guān)性的3d器官模型，從而彌補人類和動物模型之間的差距。顯著的，類器官芯片通過集成3d培養(yǎng)、動態(tài)流動等微環(huán)境因素，真實模擬人體器官的細(xì)胞組成、功能及其組織特異性。目前，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的類器官技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生理建模、疾病建模、藥物篩選和藥物機制及靶點研究等領(lǐng)域，在藥物功
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供一種基于肝類器官芯片的抗纖維化活性成分高通量篩選方法及其應(yīng)用。該專利技術(shù)有效地實現(xiàn)了器官芯片的加工、與商業(yè)孔板結(jié)合，實現(xiàn)3d纖維化肝類器官的形成和司美格魯肽的干預(yù)與評價。該體外培養(yǎng)方式重塑了體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞組分、3d組織形態(tài)等關(guān)鍵要素，不僅實現(xiàn)了體外病理肝臟模型成功構(gòu)建，同時具備候選藥物如司美格魯肽或其它藥物化合物高通量篩選的能力，再現(xiàn)人體肝臟對不同藥物的響應(yīng)。該專利技術(shù)在體外器官再造、藥物代謝、疾病發(fā)生機制探究、藥物功效評價及創(chuàng)新藥物開發(fā)方面具有極大的應(yīng)用價值。該專利技術(shù)適用于緩解肝纖維化藥物的評價方法不限于司美格魯肽，可拓展于其它成型藥物或先導(dǎo)藥物評估。
2、本專利技術(shù)提供了一種基于肝類器官芯片的抗纖維化活性成分高通量篩選方法及其應(yīng)用，其特征在于：該模型的構(gòu)建方法主要步驟為：器官芯片的加工并與商業(yè)孔板結(jié)合，3d肝纖維化類器官的形成和司美格魯肽干預(yù)與評價。
3、所述器官芯片主要由數(shù)個微孔/柱陣列單元及商業(yè)化孔板構(gòu)成，包含微型孔/柱陣列結(jié)構(gòu)，并嵌合在孔板中得到，細(xì)胞進(jìn)入孔板后滯留在微型孔/柱陣列結(jié)構(gòu)中，原位組裝并誘導(dǎo)形成類器官，培養(yǎng)基按照通過孔板進(jìn)入含微型孔陣列結(jié)構(gòu)中，16-32h(如24h)更換培養(yǎng)基。
4、所述孔/柱陣列器官芯片的材料為聚二甲基硅氧烷(pdms)。陣列單元的個數(shù)為1-8個，微型陣列結(jié)構(gòu)(1)可以是孔狀或柱狀，微孔/柱的直徑范圍為200μm-1mm，深度范圍為200μm-800μm，間距范圍為50-500μm。
5、所述器官芯片的加工，具體步驟為：采用軟光刻技術(shù)制備芯片，將形成的模板澆筑pdms預(yù)聚體得到微孔/柱陣列芯片，經(jīng)過高溫滅菌后通過pdms膠體粘合至孔板中，紫外照射滅菌。使用前通過一定濃度的pf127疏水修飾芯片，備用。
6、所述pf127修飾芯片的濃度范圍為0.1％-1％，作用時間為1-24h。
7、本專利技術(shù)提供的3d肝纖維化類器官的形成，具體步驟為：
8、(1)人多潛能干細(xì)胞向肝特異性內(nèi)胚層分化：培養(yǎng)基成分為rpmi-1640、glutamax、ksr、b27、ps、activina處理5天。
9、所述glutamax、ksr、b27范圍均為0.1-5％，activina濃度范圍為50-100ng/ml，bmp4濃度范圍為10-40ng/ml。
10、(2)向肝祖細(xì)胞分化：培養(yǎng)基成分為rpmi-1640、glutamax、ksr、b27、ps、hgf、bfgf處理5天。
11、所述glutamax、ksr、b27范圍均為0.1-5％，hgf濃度范圍為10-40ng/ml，bfgf濃度為10ng/ml
12、(3)肝細(xì)胞分化：培養(yǎng)基成分為hcm、osm、dex處理5天。
13、所述osm濃度范圍為5-20ng/ml，dex濃度范圍為10-8-10-7m。
14、(4)肝類器官形成：培養(yǎng)基成分為hcm、dex處理5天。
15、所述dex濃度范圍為10-8-10-7m。
16、(5)游離脂肪酸暴露：培養(yǎng)基成分為hcm、dex。此為病理3d肝纖維化類器官形成。
17、所述游離脂肪酸濃度范圍為100-1000μm，dex濃度范圍為10-8-10-7m。
18、本專利技術(shù)提供的降脂藥物試劑如司美格魯肽干預(yù)，具體步驟為：配制一定濃度的司美格魯肽工作液干預(yù)3d肝纖維化類器官，培養(yǎng)基成分為hcm、dex。
19、所述肝臟脂質(zhì)調(diào)節(jié)試劑如司美格魯肽的濃度范圍為10nm-100nm，司美格魯肽作用時間為2天，dex濃度范圍為10-8-10-7m。
20、所述藥物為降低纖維化水平的藥物。具體的，所屬藥物為司美格魯肽或任意一種上市藥物或先導(dǎo)化合物，司美格魯肽的濃度范圍為10nm-100nm，司美格魯肽作用時間為1-7天，dex濃度范圍為10-8-10-7m。
21、本專利技術(shù)的有優(yōu)點在于，提供了一種簡便的、快捷的、易于操作與商業(yè)化孔板結(jié)合(其中微孔/柱陣列芯片嵌合在孔板中進(jìn)行使用，并可根據(jù)不同需求制作大小或不同陣列結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞培養(yǎng)及高通量篩選單元，與不同的商業(yè)化孔板進(jìn)行結(jié)合使用)的肝臟類器官芯片模型，針對藥物研發(fā)早期活性評價缺乏合適體外模型的缺陷，利用工程學(xué)和干細(xì)胞發(fā)育學(xué)的原理，以新興的類器官技術(shù)為核心，創(chuàng)新性的建立和發(fā)展集成肝纖維化模型和藥物評價體系于一體的高通量平臺。首先該平臺實現(xiàn)了肝纖維化類器官的原位形成并可以原位成像。此外，實現(xiàn)了高仿生病理模型的構(gòu)建，同時為藥物早期功效評價和活性篩選提供了關(guān)鍵技術(shù)，最終提供了一種基于肝類器官芯片用于抗纖維化活性成分高通量篩選和應(yīng)用。經(jīng)驗證表明，該高通量平臺適用于候選藥物如司美格魯肽等生物活性評價，有效篩選具有緩解肝纖維化病癥的候選藥物。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.基于肝類器官芯片的抗纖維化活性成分高通量篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：細(xì)胞進(jìn)入孔板后滯留在微型孔/柱陣列結(jié)構(gòu)中，原位組裝并誘導(dǎo)形成類器官，培養(yǎng)基按照通過（2）進(jìn)入含微型孔陣列結(jié)構(gòu)（1）中，16-32?h（例如24?h）更換培養(yǎng)基。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述器官芯片的材料為聚二甲基硅氧烷；優(yōu)選地，高通量陣列單元的個數(shù)為數(shù)百個，微型陣列結(jié)構(gòu)（1）是孔狀或柱狀，微坑/柱的直徑范圍為200?μm-1?mm，深度范圍為200?μm-800?μm，間距范圍為50-500?μm。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S1器官芯片的加工，具體步驟為：采用軟光刻技術(shù)制備芯片，將形成的模板澆筑PDMS預(yù)聚體得到微孔/柱陣列芯片，經(jīng)過高溫滅菌后通過PDMS膠體粘合至孔板中，紫外照射滅菌；
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）中OSM濃度范圍為5-20?ng/mL，Dex濃度范圍為10-8-10-7?
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟S3藥物活性篩選的Dex濃度范圍為10-8-10-7?M。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述藥物降低3D肝纖維化類器官中脂質(zhì)、炎癥和/或纖維化水平。
9.如權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其特征在于，所述藥物為任一種已上市或者先導(dǎo)化合物，或者待篩選的藥物。
10.如權(quán)利要求1至9任一項所述的方法，其特征在于，用未知藥物是否具有肝臟脂質(zhì)調(diào)節(jié)功能（評價標(biāo)準(zhǔn)：未知藥物是否能降低肝臟脂質(zhì)、炎癥和/或纖維化水平）或者具體是將待測藥物化合物得到的評價結(jié)果，對標(biāo)準(zhǔn)有效藥物作為參照，將評價結(jié)果進(jìn)行比較來判斷。
...【技術(shù)特征摘要】
1.基于肝類器官芯片的抗纖維化活性成分高通量篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：細(xì)胞進(jìn)入孔板后滯留在微型孔/柱陣列結(jié)構(gòu)中，原位組裝并誘導(dǎo)形成類器官，培養(yǎng)基按照通過（2）進(jìn)入含微型孔陣列結(jié)構(gòu)（1）中，16-32?h（例如24?h）更換培養(yǎng)基。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述器官芯片的材料為聚二甲基硅氧烷；優(yōu)選地，高通量陣列單元的個數(shù)為數(shù)百個，微型陣列結(jié)構(gòu)（1）是孔狀或柱狀，微坑/柱的直徑范圍為200?μm-1?mm，深度范圍為200?μm-800?μm，間距范圍為50-500?μm。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟s1器官芯片的加工，具體步驟為：采用軟光刻技術(shù)制備芯片，將形成的模板澆筑pdms預(yù)聚體得到微孔/柱陣列芯片，經(jīng)過高溫滅菌后通過pdms膠體粘合至孔板中，紫外照射滅菌；
...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：尤曉顏，王慧，趙國屏，李向陽，李冰，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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