【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子標(biāo)記，具體涉及一種用于鑒定桉樹父本和品種的15重ssr標(biāo)記檢測方法，適用于快速、高效地鑒定桉樹天然授粉子代的父本及桉樹無性系的品種歸屬與真實(shí)性。
技術(shù)介紹
1、桉樹是桃金娘科(myrtaceae)桉屬(eucalyptus)、杯果木屬(angophora)和傘房桉屬(corymbia)樹種的統(tǒng)稱，具有速生豐產(chǎn)、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)價值高等優(yōu)點(diǎn)，是全球三大類造林樹種之一，亦是制漿造紙、人造板、家具、包裝、建筑、桉葉油等工業(yè)的重要原料來源。桉樹在華南地區(qū)廣泛種植，面積達(dá)8200萬畝，以不足我國5％的人工林面積生產(chǎn)了近25％的木材，因此，桉樹在維護(hù)我國木材和生態(tài)安全、促進(jìn)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面都發(fā)揮著重要作用。
2、林木(包括桉樹)研究中常利用母本和父本均相同的全同胞子代材料，其獲得一般需要進(jìn)行母本與父本間的人工控制授粉，這對于多年才開花、植株高大的林木極為不便，即使通過嫁接矮化亦存在開花時間和開花量是否滿足需要等問題。林木一般是異交，花粉傳播距離有限，母本天然授粉的花粉主要來自鄰近的父本，通過父本鑒定可確定一個母本的天然授粉的半同胞子代中、父本亦相同的全同胞子代材料。并且，當(dāng)母本與鑒定出的父本為不同樹種時，相應(yīng)子代即為種間雜種，從而有效鑒定天然雜種。
3、簡單序列重復(fù)(simple?sequence?repeat，ssr，又稱微衛(wèi)星)標(biāo)記是一種以特異引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，pcr)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，其基于2～6個堿基單元、通過重復(fù)數(shù)量的變異而形
4、此外，桉樹營林主要利用組織培養(yǎng)的無性系苗木。無性系品種在長時間的無性擴(kuò)繁和推廣過程中，會出現(xiàn)名稱混淆和以次充好等現(xiàn)象，并且育種工作產(chǎn)生的新無性系也需與現(xiàn)有無性系有效區(qū)分，都需要開發(fā)桉樹品種鑒定的有效方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，本專利技術(shù)旨在提供一種用于鑒定桉樹父本和/或品種的15重ssr標(biāo)記檢測方法。
2、對前期開發(fā)的桉樹132個ssr標(biāo)記進(jìn)行多重組合和分型檢測，通過大量實(shí)驗(yàn)篩選和優(yōu)化確定了本專利技術(shù)中的15重?zé)晒鈾z測方法。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)篩選、優(yōu)化和驗(yàn)證所得到的15重ssr標(biāo)記檢測方法，對隨機(jī)樣品都可以有效擴(kuò)增和清晰分型，適用于快速、高效地鑒定桉樹天然授粉子代的父本和確定是否天然雜種以及檢測桉樹無性系的品種歸屬與真實(shí)性。
3、本次專利技術(shù)的用于鑒定桉樹父本和/或品種的15重ssr標(biāo)記檢測方法，15對ssr標(biāo)記檢測引物組是混合在同一個pcr體系中同時完成pcr反應(yīng)。具體內(nèi)容如下：
4、1、專利技術(shù)中所述的15重ssr標(biāo)記檢測引物組，由以下15對ssr標(biāo)記檢測引物組成：
5、eucessr0568的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.1所示，后向引物的序列如seq?id?no.2所示；
6、eucessr536的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.3所示，后向引物的序列如seq?id?no.4所示；
7、eucessr0957的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.5所示，后向引物的序列如seq?id?no.6所示；
8、eucessr046的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.7所示，后向引物的序列如seq?id?no.8所示；
9、eucessr1007的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.9所示，后向引物的序列如seq?id?no.10所示；
10、eucessr537的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.11所示，后向引物的序列如seq?id?no.12所示；
11、eucessr509的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.13所示，后向引物的序列如seq?id?no.14所示；
12、eucessr241的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.15所示，后向引物的序列如seq?id?no.16所示；
13、eucessr668的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.17所示，后向引物的序列如seq?id?no.18所示；
14、eucessr1098的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.19所示，后向引物的序列如seq?id?no.20所示；
15、eucessr683的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.21所示，后向引物的序列如seq?id?no.22所示；
16、eucessr0056的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.23所示，后向引物的序列如seq?id?no.24所示；
17、eucessr1127的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.25所示，后向引物的序列如seq?id?no.26所示；
18、eucessr349的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.27所示，后向引物的序列如seq?id?no.28所示；
19、eucessr1018的引物對，其前向引物的序列如seq?id?no.29所示，后向引物的序列如seq?id?no.30所示。
20、2、專利技術(shù)中所述的ssr標(biāo)記檢測引物組，15個引物對的5’端的熒光修飾情況如下：
21、eucessr0568、eucessr536、eucessr0957、eucessr046、eucessr1007的引物對的5’端用紅色發(fā)光物質(zhì)rox修飾；
22、eucessr537、eucessr509、eucessr241、eucessr668、eucessr1098的引物對的5’端用黑色熒光物質(zhì)tamara修飾；
23、eucessr683、eucessr0056、eucessr1127、eucessr349、eucessr1018的引物對的5’端用綠色熒光物質(zhì)hex修飾。
24、3、專利技術(shù)中所述的ssr標(biāo)記檢測引物組用于鑒定桉樹父本，步驟如下：
25、s1.提取待鑒定的桉樹子代、母本桉樹和候選父本桉樹的dna；
26、s2.以步驟s1提取的dna為相應(yīng)模板dna，利用所述的15重ssr標(biāo)記檢測引物組進(jìn)行pcr反應(yīng)，獲得pcr產(chǎn)物；
27、s3.對pcr產(chǎn)物進(jìn)行檢測和ssr標(biāo)記分型；
28、s4.將待鑒定的子代桉樹的ssr等位片段與母本桉樹及候選父本桉樹的ssr等位片段進(jìn)行比對，確定待鑒定子代桉樹的父本。
29、4、專利技術(shù)中所述的ssr標(biāo)記檢測引物組用于鑒定桉樹品種，步驟如下：
30、s1.提取待品種鑒定桉樹和相關(guān)候選桉樹品種的dna本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.用于鑒定桉樹父本和/或品種的15重SSR標(biāo)記檢測引物組，其特征在于，由以下15對引物組成：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的15重SSR標(biāo)記檢測引物組中的15對引物的5’端的熒光修飾情況如下：
3.用于鑒定桉樹父本的15重SSR標(biāo)記檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)的體系總體積為25μL，包括12.5μL?PCR緩沖液、7.375μL權(quán)利要求2中所述的15重SSR標(biāo)記檢測引物組的混合物、10UTaq?DNA聚合酶、40ng模板DNA，余量為ddH2O。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的15重SSR標(biāo)記檢測引物組的混合物中的不同引物對在PCR反應(yīng)的體系中的終濃度如下：
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。
7.用于鑒定桉樹品種的15重SSR標(biāo)記檢測方法，其特征在于，包括以
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)的體系總體積為25μL，包括12.5μL?PCR緩沖液、7.375μL權(quán)利要求2中所述的15重SSR標(biāo)記檢測引物組的混合物、10UTaq?DNA聚合酶、40ng模板DNA，余量為ddH2O。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的15重SSR標(biāo)記檢測引物組的混合物中的不同引物對在PCR反應(yīng)的體系中的終濃度如下：
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于鑒定桉樹父本和/或品種的15重ssr標(biāo)記檢測引物組，其特征在于，由以下15對引物組成：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的15重ssr標(biāo)記檢測引物組中的15對引物的5’端的熒光修飾情況如下：
3.用于鑒定桉樹父本的15重ssr標(biāo)記檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pcr反應(yīng)的體系總體積為25μl，包括12.5μl?pcr緩沖液、7.375μl權(quán)利要求2中所述的15重ssr標(biāo)記檢測引物組的混合物、10utaq?dna聚合酶、40ng模板dna，余量為ddh2o。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的15重ssr標(biāo)記檢測引物組的混合物中的不同引物對在pcr反應(yīng)的體系中的終濃度如下：
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的pcr反應(yīng)的反應(yīng)程序...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李梅，周明明，甘四明，翁啟杰，徐家洪，
申請(專利權(quán))人：中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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