【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程，具體涉及創(chuàng)制整合有外源賴氨酸脫羧酶的大腸桿菌及其應(yīng)用，尤其涉及一種生產(chǎn)戊二胺的工程菌株及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、戊二胺作為賴氨酸脫羧的產(chǎn)物，其與單體二元酸可以合成多種生物基尼龍5x，如尼龍52、5t、54、56等，不同類型的尼龍5x具有耐高溫、中高溫、中低溫和低溫特性，因此相較于傳統(tǒng)的石油基尼龍，如尼龍6、尼龍66等，其優(yōu)勢更為明顯，是目前全球范圍內(nèi)公認(rèn)的尼龍新材料，未來在纖維和工程塑料等領(lǐng)域更具發(fā)展前景。
2、目前，國內(nèi)外生物法合成戊二胺主要有兩種途徑，即微生物發(fā)酵從頭合成和全細(xì)胞催化。賴氨酸脫羧酶作為生物法合成戊二胺的關(guān)鍵酶，其來源廣泛，比如大腸桿菌(escherichia?coli)、蜂房哈夫尼菌(hafnia?alvei)、耐堿芽胞桿菌(bacillushalodurans)、蠟樣芽胞桿菌(bacillus?cereus)、尸桿菌(bacterium?cadaveris)、伯克霍爾德氏菌(burkholderia?vietnamensia)、青紫色素桿菌(chromobacterium?violaceum)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonella?typhimurium)等細(xì)菌，因此，創(chuàng)制高效的賴氨酸脫羧酶工程菌株是生物法合成戊二胺的關(guān)鍵。
3、大腸桿菌基因操作簡便，用于其體內(nèi)蛋白表達的載體眾多，是當(dāng)前最常用的表達宿主，目前基于大腸桿菌的代謝工程策略，其普遍采用質(zhì)粒作為表達載體，但質(zhì)粒的存在往往會導(dǎo)致菌株代謝負(fù)擔(dān)過重、分離不穩(wěn)定以及存在傳代、工業(yè)放大過程中功能質(zhì)粒丟失的情況；
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株及其應(yīng)用。本專利技術(shù)將外源賴氨酸脫羧酶整合到常用的大腸桿菌蛋白表達宿主基因組上，使目的基因在宿主菌中遺傳穩(wěn)定性提高，進而改變大腸桿菌的生長特性，使之具有更強的環(huán)境適應(yīng)能力，更好的戊二胺生產(chǎn)前景。
2、為達到此專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供一種穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，所述工程菌株由包括如下步驟的方法制備得到：
4、在大腸桿菌中轉(zhuǎn)入賴氨酸脫羧酶整合載體，所述賴氨酸脫羧酶整合載體中包括自殺型復(fù)制子、啟動子、目的基因、抗性基因和整合位點；篩選陽性菌株，敲除所述陽性菌株中的自殺型復(fù)制子和抗性基因，得到所述工程菌株；
5、所述自殺型復(fù)制子為r6k復(fù)制子；
6、所述目的基因為賴氨酸脫羧酶基因cada，所述賴氨酸脫羧酶基因為來自于蜂房哈夫尼菌(hafnia?alvei)、耐堿芽胞桿菌(bacillus?halodurans)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、尸桿菌(bacterium?cadaveris)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiavietnamensia)、青紫色素桿菌(chromobacterium?violaceum)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、毛鏈霉菌(streptomyces?polosus)、反芻動物月形單胞菌(selenomonasruminantium)、遲緩愛德華氏菌(edwardsiella?tarda)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、邦戈沙門氏菌(salmonella?bongori)、沙雷氏菌屬(serratia)、博代氏桿菌屬(bordetella)、霍亂弧菌(vibrio?cholerae)、非保密氣單胞菌屬(unclassifiedaeromonas)或克雷伯氏菌屬(klebsiella)等菌的賴氨酸脫羧酶基因及其突變體中任意一種；
7、所述目的基因上游的啟動子為t7啟動子；
8、所述抗性基因為氯霉素抗性基因；
9、所述整合位點為is序列，所述is序列為is3序列，所述is序列的堿基序列如seqidno.2所示。
10、本專利技術(shù)中所述賴氨酸脫羧酶基因cada的序列為經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性調(diào)整基因的同義密碼子，達到消除稀有密碼子的目的，從而提高翻譯效率。
11、本專利技術(shù)提供了一種整合了外源賴氨酸脫羧酶的基因工程菌，還提供了一種大腸桿菌基因組整合載體，整合方法簡單且遺傳穩(wěn)定，可最終實現(xiàn)外源賴氨酸脫羧酶穩(wěn)定高效表達，促進戊二胺的生產(chǎn)。
12、本專利技術(shù)中，所述整合載體使用自殺型復(fù)制子，優(yōu)選為r6k復(fù)制子，含r6k復(fù)制子的質(zhì)粒只有在含有pir基因的宿主菌中才能復(fù)制擴增，在普通菌株(如本專利技術(shù)中的大腸桿菌宿主)中只有整合至基因組中才能在有抗性的培養(yǎng)基上生長，這就去除了質(zhì)粒模板的背景干擾，以便后續(xù)菌株的篩選。
13、優(yōu)選地，所述賴氨酸脫羧酶整合載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：
14、(1)構(gòu)建賴氨酸脫羧酶基因表達框，所述表達框為：啟動子t7--蛋白結(jié)合位點--rbs--目的基因cada--終止子；
15、(2)構(gòu)建整合框，所述整合框為：整合位點is3--r6k復(fù)制子--氯霉素抗性基因片段；
16、(3)構(gòu)建賴氨酸脫羧酶基因整合載體，將所述整合框和賴氨酸脫羧酶基因表達框經(jīng)酶切連接得到賴氨酸脫羧酶整合載體，所述賴氨酸脫羧酶整合載體包括：整合位點is3--r6k復(fù)制子--氯霉素抗性基因片段--賴氨酸脫羧酶基因表達框。
17、優(yōu)選地，以基因組中is3序列為整合位點，借助peccas質(zhì)粒中λ-red重組系統(tǒng)輔助完成賴氨酸脫羧酶的整合。
18、本專利技術(shù)中，所述整合位點為轉(zhuǎn)座元件is序列。is序列為大腸桿菌基因組的正常組成成分，其拷貝數(shù)較多，作為最簡單的轉(zhuǎn)座因子，其不含任何宿主基因；基于整合載體，以is序列作為同源序列利用單交換原理就可實現(xiàn)整合載體與大腸桿菌基因組間的重組，從而實現(xiàn)目的基因多拷貝整合到大腸桿菌基因組中。
19、優(yōu)選地，敲除所述陽性轉(zhuǎn)化菌中的自殺型復(fù)制子和抗性基因采用crispr/cpf1結(jié)合λ-red重組系統(tǒng)進行。
20、本專利技術(shù)提供了一種基于crispr/cpf1結(jié)合λ-red重組系統(tǒng)的大腸桿菌基因敲除策略，可在某種程度上實現(xiàn)大腸桿菌b系列菌株中的目的片段敲除。
21、大腸桿菌常規(guī)的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)(pcas質(zhì)粒和ptargetf雙質(zhì)粒系統(tǒng))難以實現(xiàn)大腸桿菌b系列菌株(如e.coli?bl21(de3))中目的基因的敲除，表現(xiàn)為難以獲得敲除轉(zhuǎn)化子。為解決上述技術(shù)問題和消除本專利技術(shù)中整合菌株中的抗性篩選標(biāo)記，本專利技術(shù)提供了一種基于crispr/cpf1結(jié)合λ-red重組系統(tǒng)的大腸桿菌基因編輯策略，該編輯策略主要包括基于crispr/cpf1系統(tǒng)的質(zhì)粒pjys3_δcrtyf，含λ-red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒peccas對抗性篩選標(biāo)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株由包括如下步驟的方法制備得到：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述賴氨酸脫羧酶整合載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，以基因組中IS3序列為整合位點，借助pECCas質(zhì)粒中λ-Red重組系統(tǒng)輔助完成賴氨酸脫羧酶的整合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，敲除所述陽性轉(zhuǎn)化菌中的自殺型復(fù)制子和抗性基因采用CRISPR/Cpf1結(jié)合λ-Red重組系統(tǒng)進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述敲除的步驟具體為：將pEC_ΔR6K-CM質(zhì)粒和R6K復(fù)制子--氯霉素抗性基因上下游同源臂轉(zhuǎn)入所述陽性轉(zhuǎn)化菌中，敲除R6K復(fù)制子--氯霉素抗性基因片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述pEC_ΔR6K-CM質(zhì)粒中包括FnCpf1核酸酶、RED重組酶和crRNA識別序列；
7.根據(jù)權(quán)利
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述R6K復(fù)制子--氯霉素抗性基因上下游同源臂的堿基序列如SEQ?ID?No.20所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli?BL21(DE3)。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株在生產(chǎn)戊二胺中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株由包括如下步驟的方法制備得到：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述賴氨酸脫羧酶整合載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，以基因組中is3序列為整合位點，借助peccas質(zhì)粒中λ-red重組系統(tǒng)輔助完成賴氨酸脫羧酶的整合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，敲除所述陽性轉(zhuǎn)化菌中的自殺型復(fù)制子和抗性基因采用crispr/cpf1結(jié)合λ-red重組系統(tǒng)進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定生產(chǎn)戊二胺的工程菌株，其特征在于，所述敲除的步驟具體為：將pec_δr6k-cm質(zhì)粒和r6k復(fù)制子--氯霉素抗性基因上下游同源臂轉(zhuǎn)入所述陽性轉(zhuǎn)化菌中，敲除r...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃玉紅，張弟參，張鎖江，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院過程工程研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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