【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于修飾植物中的fasciated?ear2?(fea2)基因(任選地以改變分生組織大小)的組合物和方法。?本專利技術還涉及使用本專利技術的方法和組合物產生的具有增加的籽粒行數的植物。
技術介紹
1、新的植物器官在稱為分生組織的植物生長頂端開始。?在分生組織中，維持著未分化的干細胞群體。在生長期間，分生組織將干細胞分配給新形成的器官，包括種子，同時保留一些干細胞以繼續維持分生組織。已經描述了幾種保守的分子機制，其控制干細胞群體的大小以確保有組織的生長和適當的分生組織大小。
2、由于玉米穗發育的模塊化性質，較大的分生組織往往引發更多的花，因此，分生組織大小對籽粒行數和產量具有直接影響。在玉米穗發育期間引發的花的數量直接限制谷物產量。在玉米馴化期間選擇的一個主要性狀是圍繞穗周開始的花的數量增加(籽粒行數或krn)。?通過育種取得的顯著進步已經導致籽粒行數的急劇增加，從玉米祖先大芻草的2行增加到現代良種玉米品種的約8至20行。在不同的玉米品系中，籽粒行數可達到高達36。
3、在模式植物擬南芥(arabidopsis)中描述的典型調節途徑中，clavata3?(clv3)肽從分生組織頂端的細胞中分泌并且通過質外體移動到中央干細胞結構域中，在該中央干細胞結構域其與幾種富含亮氨酸的受體(lrr)(包括clavata1?(clv1)和clavata2?(clv2))相互作用。?這種受體-配體相互作用刺激信號傳導，這最終用于降低wus表達并限制干細胞群體的擴增。?wus的靶標之一是clv3基因本身，并且wu
4、clv1、clv2或clv3的功能喪失突變導致wus結構域的擴增和增加的分生組織大小(schoof等人,?cell?100:?635–644?(2000))。?通常，分生組織大小的這種增加會導致異常的植物生長，因為分生組織不受控制地擴大并變得無組織，這種現象被稱為束化(fasciation)(je等人,?nat?genet?48:?ng.3567?(2016a))。?重要的是，更大的分生組織不僅僅制造更大的器官，而是在更大的區域周圍增加器官的數量。?由于分生組織大小和器官數量之間的這種關系，玉米clv-wus信號傳導基因的突變可導致花數量和產量增加。然而，雖然玉米clv2直向同源fasciated?ear2?(fea2)?中的強的功能喪失突變導致分生組織擴大和krn增加，但穗是無序的，因此產量沒有增加(taguchi-shiobara等人,?gene?dev15:2755–2766?(2001))。
5、需要用于調節分生組織大小的新策略來改良作物性能。
技術實現思路
1、本專利技術的一方面提供了一種在編碼fea2蛋白質的內源fasciated?ear2?(fea2)基因中包含至少一個突變的玉米植物或其植物部分，任選地其中該至少一個突變可以是非天然突變。
2、本專利技術的第二方面提供了一種玉米植物細胞，其包含編輯系統，該編輯系統包含：(a)?crispr-cas效應蛋白；和(b)包含與編碼fea2蛋白的內源靶基因互補的間隔區序列的引導核酸(grna、gdna、crrna、crdna、sgrna、sgdna)。
3、本專利技術的第三方面提供了一種在fea2基因內包含至少一個突變的玉米植物細胞，其中該突變是使用編輯系統引入的置換、插入或缺失，該編輯系統包含與fea2基因中的靶位點結合的核酸結合結構域，任選地其中該至少一個突變可以是非天然突變。
4、本專利技術的第四方面提供了一種產生/培育不含轉基因的編輯的玉米植物的方法，該方法包括：將本專利技術的玉米植物與不含轉基因的玉米植物雜交，從而將該至少一個突變引入不含轉基因的玉米植物中；以及選擇包含該至少一個突變且不含轉基因的后代玉米植物，從而產生不含轉基因的編輯的玉米植物，任選地其中該至少一個突變可以是非天然突變。
5、本專利技術的第五方面提供了一種提供具有增加的籽粒行數的多種玉米植物的方法，該方法包括在生長區域中種植兩種或更多種本專利技術的植物，從而提供與不包含該突變的多種對照玉米植物相比具有增加的籽粒行數的多種玉米植物。
6、本專利技術的第六方面提供了一種在玉米fea2蛋白質的區域中產生變異的方法，該方法包括：將編輯系統引入玉米植物細胞中，其中該編輯系統靶向編碼fea2多肽的fea2基因的區域，以及將該fea2基因的該區域與該編輯系統接觸，從而將突變引入該fea2基因中并在該玉米植物細胞的fea2蛋白的區域中產生變異。
7、本專利技術的第七方面提供了一種檢測玉米植物中的突變的fea2基因(在內源fea2基因中的突變)的方法，該方法包括在該玉米植物的基因組中檢測在與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域中具有至少一個突變的fea2基因。
8、在第八方面，提供了一種在玉米植物的內源fea2基因中產生突變的方法，該方法包括：(a)將基因編輯系統靶向fea2基因的一部分，該部分包含與seq?id?no:75-77中的任一者具有至少80%序列同一性的序列；以及(b)選擇包含位于與seq?id?no:75-77中的任一者具有至少80%序列同一性的fea2基因區域中的修飾的玉米植物。
9、第九方面提供了一種編輯玉米植物細胞基因組中的特定位點的方法，該方法包括：以位點特異性方式切割玉米植物細胞中的內源fea2基因內的靶位點，該內源fea2基因：(a)包含與seq?id?no:72或seq?id?no:73具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；(b)包含與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域；(c)編碼與seq?idno:74具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；和/或(d)編碼包含與seq?id?no:78-80具有至少90%序列同一性的區域的多肽，從而在玉米植物細胞的內源fea2基因中產生編輯，并產生包含內源fea2基因中的編輯的玉米植物細胞。
10、第十方面提供了一種制備玉米植物的方法，該方法包括：(a)將包含野生型內源fea2基因的玉米植物細胞群體與連接至核酸結合結構域(例如，編輯系統)的核酸酶接觸，該核酸結合結構域結合至與seq?id?no:75-77中任一者的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的序列或結合至編碼與seq?id?no:78-80中的任一者具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的序列；(b)從其中內源fea2基因已經突變的群體中選擇玉米植物細胞，從而產生在內源fea2基因中包含至少一個突變的玉米植物細胞；以及(c)使所選擇的玉米植物細胞生長成玉米植物。
11、第十一方面提供了一種用于增加玉米植物中的籽粒行數的方法，該方法包括(a)將包含內源fea2基因的玉米植物細胞與靶向內源fea2基因的核酸酶接觸，其中該核酸酶連接至與內源fea2基因本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種玉米植物或其植物部分，所述玉米植物或其植物部分包含在編碼FEA2多肽的內源FASCIATED?EAR2?(FEA2)基因中的至少一個突變。
2.如權利要求1所述的玉米植物或其部分，其中所述內源?FASCIATED?EAR2?(FEA2)基因具有Zm00001d051012的基因標識號(基因ID)。
3.如權利要求1或權利要求2所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是顯性負突變或弱功能喪失突變。
4.如權利要求1至3中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是堿基置換、缺失和/或插入。
5.如權利要求4所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是缺失，任選地框內缺失或框外缺失。
6.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變包含對A、T、G或C的堿基置換。
7.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變位于參考所編碼的FEA2多肽SEQ?ID?NO:74的第10個LRR重復序列中。
8.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其
9.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致位于參考SEQ?ID?NO:74的氨基酸位置編號的第332位處的置換的氨基酸殘基。
10.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致G332的置換。
11.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述內源FASCIATEDEAR2?(FEA2)基因(a)包含與SEQ?ID?NO:72或SEQ?ID?NO:73具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；(b)包含與SEQ?ID?NO:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域；(c)編碼與SEQ?ID?NO:74具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；和/或(d)編碼與SEQ?IDNO:78-80的任一氨基酸序列具有至少90%序列同一性的區域。
12.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致突變的FEA2多肽具有改變的與其他多肽復合的能力，和/或改變的穿過質膜和/或從內質網定位到質膜的能力。
13.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中與缺乏所述至少一個突變的對照植物相比，包含所述至少一個突變的所述玉米植物表現出增加的產量，任選地其中所述玉米植物表現出增加的籽粒行數(KRN)的表型，任選地其中穗長度基本上不減少。
14.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是非天然突變。
15.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致突變的FEA2基因，所述突變的FEA2基因包含與SEQ?ID?NO:82、84、86、88、90、92、94、96或98中的任一者具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，并且/或者編碼與SEQ?ID?NO:83、85、87、89、91、93、95、97或99中的任一者具有至少90%序列同一性的突變的FEA2多肽。
16.一種玉米植物細胞，所述植物細胞包含編輯系統，所述編輯系統包含：
17.如權利要求16所述的玉米植物細胞，其中所述內源靶基因(a)包含與SEQ?ID?NO:72或SEQ?ID?NO:73具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，(b)包含與SEQ?ID?NO:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域，(c)編碼與SEQ?ID?NO:74具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，和/或(d)編碼包含與SEQ?ID?NO:78-80的任一氨基酸序列具有至少90%序列同一性的區域的多肽。
18.如權利要求16或權利要求17所述的玉米植物細胞，其中所述引導核酸包含SEQ?IDNO:81的核苷酸序列。
19.一種從如權利要求1至15中任一項所述的玉米植物部分或如權利要求16至18中任一項所述的玉米植物細胞再生的玉米植物。
20.如權利要求19所述的玉米植物，其中所述玉米植物表現出增加的產量并且/或者表現出增加的籽粒行數，任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少。
21.如權利要求19或權利要求20所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含突變的FEA2基因，所述突變的FEA2基因包含與SEQ?ID?NO:82、84、86、88、90、92、94、96或98中的任一者具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，并且/或者編碼與SEQ?ID?NO:83、85...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種玉米植物或其植物部分，所述玉米植物或其植物部分包含在編碼fea2多肽的內源fasciated?ear2?(fea2)基因中的至少一個突變。
2.如權利要求1所述的玉米植物或其部分，其中所述內源?fasciated?ear2?(fea2)基因具有zm00001d051012的基因標識號(基因id)。
3.如權利要求1或權利要求2所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是顯性負突變或弱功能喪失突變。
4.如權利要求1至3中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是堿基置換、缺失和/或插入。
5.如權利要求4所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是缺失，任選地框內缺失或框外缺失。
6.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變包含對a、t、g或c的堿基置換。
7.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變位于參考所編碼的fea2多肽seq?id?no:74的第10個lrr重復序列中。
8.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致經修飾的截短的fea2多肽。
9.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致位于參考seq?id?no:74的氨基酸位置編號的第332位處的置換的氨基酸殘基。
10.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致g332的置換。
11.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述內源fasciatedear2?(fea2)基因(a)包含與seq?id?no:72或seq?id?no:73具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；(b)包含與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域；(c)編碼與seq?id?no:74具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；和/或(d)編碼與seq?idno:78-80的任一氨基酸序列具有至少90%序列同一性的區域。
12.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致突變的fea2多肽具有改變的與其他多肽復合的能力，和/或改變的穿過質膜和/或從內質網定位到質膜的能力。
13.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中與缺乏所述至少一個突變的對照植物相比，包含所述至少一個突變的所述玉米植物表現出增加的產量，任選地其中所述玉米植物表現出增加的籽粒行數(krn)的表型，任選地其中穗長度基本上不減少。
14.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變是非天然突變。
15.如前述權利要求中任一項所述的玉米植物或其部分，其中所述至少一個突變導致突變的fea2基因，所述突變的fea2基因包含與seq?id?no:82、84、86、88、90、92、94、96或98中的任一者具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，并且/或者編碼與seq?id?no:83、85、87、89、91、93、95、97或99中的任一者具有至少90%序列同一性的突變的fea2多肽。
16.一種玉米植物細胞，所述植物細胞包含編輯系統，所述編輯系統包含：
17.如權利要求16所述的玉米植物細胞，其中所述內源靶基因(a)包含與seq?id?no:72或seq?id?no:73具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，(b)包含與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域，(c)編碼與seq?id?no:74具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，和/或(d)編碼包含與seq?id?no:78-80的任一氨基酸序列具有至少90%序列同一性的區域的多肽。
18.如權利要求16或權利要求17所述的玉米植物細胞，其中所述引導核酸包含seq?idno:81的核苷酸序列。
19.一種從如權利要求1至15中任一項所述的玉米植物部分或如權利要求16至18中任一項所述的玉米植物細胞再生的玉米植物。
20.如權利要求19所述的玉米植物，其中所述玉米植物表現出增加的產量并且/或者表現出增加的籽粒行數，任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少。
21.如權利要求19或權利要求20所述的玉米植物，其中所述玉米植物包含突變的fea2基因，所述突變的fea2基因包含與seq?id?no:82、84、86、88、90、92、94、96或98中的任一者具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，并且/或者編碼與seq?id?no:83、85、87、89、91、93、95、97或99中的任一者具有至少90%序列同一性的突變的fea2多肽。
22.一種包含fea2基因內的至少一個突變的玉米植物細胞，其中所述突變是使用編輯系統引入的置換、插入或缺失，所述編輯系統包含與fea2基因中的靶位點結合的核酸結合結構域。
23.如權利要求22所述的玉米植物細胞，其中所述至少一個突變是顯性負等位基因或弱功能喪失等位基因。
24.如權利要求22或權利要求23所述的玉米植物細胞，其中所述靶位點位于所述fea2基因的區域內，所述區域包含與seq?id?no:75-77中任一者的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的序列。
25.如權利要求22至24中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述編輯系統還包含核酸酶，所述核酸結合結構域結合至與seq?id?no:75-77中任一者的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的序列內的靶位點，并且在被所述核酸酶切割后產生在fea2基因內的至少一個突變。
26.如權利要求25所述的玉米植物細胞，其中所述核酸酶是鋅指核酸酶、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(talen)、核酸內切酶(例如，fok1)或crispr-cas效應蛋白。
27.如權利要求22至26中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述核酸結合結構域是鋅指、轉錄激活因子樣dna結合結構域(tal)、argonaute或crispr-cas效應物核酸結合結構域。
28.如權利要求22至27中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述fea2基因內的所述至少一個突變是置換或缺失，任選地框內缺失或框外缺失。
29.如權利要求22至28中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述fea2基因內的所述至少一個突變包括點突變。
30.如權利要求22至29中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述至少一個突變位于參考所編碼的fea2多肽的第10個lrr重復序列中。
31.如權利要求22至30中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述至少一個突變導致位于參考seq?id?no:74的氨基酸位置編號的第322位處的置換的氨基酸殘基，任選地其中所述至少一個突變導致g332的置換。
32.如權利要求22至31中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述至少一個突變導致突變的fea2多肽具有改變的與其他多肽復合的能力，和/或改變的穿過質膜和/或從內質網定位到質膜的能力。
33.如權利要求22至32中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述至少一個突變是非天然突變。
34.如權利要求22至33中任一項所述的玉米植物細胞，其中所述至少一個突變導致突變的fea2基因，其與seq?id?no:82、84、86、88、90、92、94、96或98中的任一者具有至少90%序列同一性，并且/或者編碼與seq?id?no:83、85、87、89、91、93、95、97或99中的任一者具有至少90%序列同一性的突變的fea2多肽。
35.一種玉米植物，所述玉米植物從如權利要求22至34中任一項所述的玉米植物細胞再生，所述玉米植物細胞包含在所述fea2基因內的所述至少一個突變。
36.如權利要求35所述的玉米植物，其中當與不包含含有所述至少一個突變的fea2基因的對照植物相比時，所述玉米植物表現出增加的產量和/或增加的籽粒行數的表型，任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少。
37.一種產生/培育無轉基因的編輯玉米植物的方法，所述方法包括：
38.一種提供具有增加的產量和/或增加的籽粒行數的多株玉米植物的方法，所述方法包括兩株或更多株如權利要求1至15、19至21、35或36中任一項所述的植物種植在生長區域中，從而提供與缺乏所述至少一個突變的多株對照玉米植物相比具有增加的產量和/或增加的籽粒行數的多株玉米植物。
39.一種在玉米植物的內源fea2基因中產生突變的方法，所述方法包括：
40.一種在玉米fea2蛋白質的區域中產生變異的方法，所述方法包括：
41.如權利要求40所述的方法，其中所述fea2基因：(a)包含與seq?id?no:72或seq?idno:73具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，(b)包含與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域，(c)編碼與seq?id?no:74具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，和/或(d)編碼包含與seq?id?no:78-80的任一氨基酸序列具有至少90%序列同一性的區域的多肽。
42.如權利要求40或權利要求41所述的方法，其中被靶向的所述fea2基因的所述區域包含與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列至少90%的序列同一性。
43.如權利要求40至42中任一項所述的方法，其中將所述玉米植物細胞中的所述內源fea2基因的所述區域與所述編輯系統接觸產生在其基因組中包含編輯的內源fea2基因的玉米植物細胞，所述方法還包括(a)從所述玉米植物細胞再生玉米植物；(b)使所述玉米植物自交以產生玉米后代植物(e1)；(c)測定(b)的所述后代植物的產量增加和/或籽粒行數增加(任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少)；以及(d)選擇表現出增加的產量和/或增加的籽粒行數(任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少)的后代玉米植物，以產生與對照玉米植物相比表現出增加的產量和/或增加的籽粒行數(任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少)的所選擇的后代玉米植物。
44.如權利要求43所述的方法，所述方法還包括(e)使(d)的所選擇的后代玉米植物自交以產生玉米后代植物(e2)；(f)測定(e)的所述后代玉米植物的產量增加和/或籽粒行數增加(任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少)；以及(g)選擇與對照玉米植物相比表現出增加的產量和/或增加的籽粒行數(任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少)的后代玉米植物，以產生表現出增加的產量和/或增加的籽粒行數(任選地其中當籽粒行數增加時，穗長度基本上不減少)的所選擇的后代玉米植物，任選地再重復(e)至(g)一次或多次。
45.一種檢測玉米植物中的突變的fea2基因(在內源fea2基因中的突變)的方法，所述方法包括在所述玉米植物的基因組中檢測在與seq?id?no:75-77的任一核苷酸序列具有至少90%序列同一性的區域中具有至少一個突變的fea2基因。
46.如權利要求45所述的方法，其中被檢測的所述突變的fea2基因包含與seq?id?no:82、84、86、88、90、92、94、96或98中的任一者具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，并且/或者編碼與seq?id?no:83、85、87、89、91、93、95、97或99中的任一者具有至少90%序列同一性的突變的fea2多肽。
47.一種用于編輯玉米植物細胞基因組中的特定位點的方法，所述方法包...
【專利技術屬性】
技術研發人員：D·L·奧康納，
申請(專利權)人：成對植物服務股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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