【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及試劑盒，具體涉及一種前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒及檢測方法。
技術介紹
1、前列腺疾病是老年男性的常見疾病，臨床上前列腺病變主要包括前列腺炎、良性前列腺增生和前列腺癌等。其診斷在很大程度上依賴穿刺活檢標本的病理學檢查，而免疫組化技術在其病理輔助診斷中占有重要地位。常規的免疫組化技術只能在一張切片上作一種抗體的染色。但由于穿刺活檢標本組織量少，當標本中腫瘤/可疑的細胞等過少時，常規的免疫組化技術往往會給病理診斷造成一定困境。
2、p504s是前列腺癌特異標記物，在前列腺癌中高表達，正常前列腺組織不表達，但在前列腺上皮內瘤變（pin)及不典型增生（aah）組織中可有散在弱表達。p63和hmwck分別標記前列腺基底細胞的胞核和胞漿，二者組合可提高基底細胞的識別能力。正常前列腺腺體有兩層細胞（基底細胞和腺上皮細胞），而前列腺癌則沒有或僅殘留少量基底細胞，這樣采用三種組合式抗體就能在同一張切片中直接觀察各種病變，便于比較，有利于前列腺癌、pin和ahh的診斷和鑒別診斷。適用切除活檢和穿刺活檢標本檢查，尤其對疑難病例有幫助。
3、目前已有的前列腺病變組織免疫組化雙染試劑盒采用組合式單克隆抗體和雙酶標記法，可以實現在一張前列腺組織切片中同時檢測三種抗原，但該項技術由于使用的是即用型組合抗體，這就要求抗體來源種屬需不同，不能都選用特異性強和親和力強的兔單抗，而且對應的抗體也無法用于其它研究，且會引起循環染色，實驗周期相較于前列腺病變組織免疫組化雙染試劑盒周期長。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提出一種前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒及檢測方法，采用非生物素放大系統，較傳統雙染實驗大大縮短了實驗時間，并有效避免了內源性生物素的干擾。適用于前列腺切除標本、針刺活檢標本、電切標本、經尿道切除標本的前列腺癌、pin、aah診斷和鑒別診斷，尤其適用于常規福爾馬林固定石蠟包埋切片。
2、本專利技術的技術方案是這樣實現的：
3、本專利技術提供一種前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，由以下原料按重量份制備而成：tyr-xxxplus熒光染料40-60份、tsa?buffer?30-45份、polymer-hrp單抗鼠/兔二抗20-40份、抗體15-30份、dapi染液5-15份、抗體稀釋液50-70份、過氧化酶封閉液50-70份。
4、作為本專利技術的進一步改進，所述tyr-xxxplus熒光染料選自tyr-480plus熒光染料、tyr-520plus熒光染料、tyr-570plus熒光染料、tyr-620plus熒光染料、tyr-690plus熒光染料、tyr-780plus熒光染料中的任意三種；所述抗體包括一抗p504s、一抗p63、一抗ck，質量比為10:12-15:10。
5、作為本專利技術的進一步改進，所述抗體稀釋液由以下原料按重量份制備而成：pbs緩沖液80-100份、牛血清蛋白0.5-1份、海藻糖0.5-2份、甘油20-40份、表面活性劑0.5-1份、防腐劑0.1-0.5份。
6、作為本專利技術的進一步改進，所述表面活性劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種。
7、作為本專利技術的進一步改進，所述防腐劑的制備方法如下：
8、s1.?月桂酸維生素c酯的制備：將月桂酸、維生素c加入甲苯中，加入濃硫酸，加熱回流反應，反應液依次用飽和碳酸鈉、水洗滌，收集有機層，經過柱層析色譜分離，獲得月桂酸維生素c酯；
9、s2.?羧基化殼聚糖的制備：將殼聚糖溶于酸液中，加入α-酮戊二酸，加熱攪拌反應，加入硼氫化鈉，攪拌反應，加入乙醇沉淀，洗滌，干燥，制得羧基化殼聚糖；
10、s3.?防腐劑的制備：將羧基化殼聚糖、月桂酸維生素c酯加入甲苯中，加入濃硫酸，加熱回流反應，加入乙醇沉淀，洗滌，干燥，制得防腐劑。
11、作為本專利技術的進一步改進，步驟s1中所述月桂酸、維生素c的摩爾比為1:0.9-1，所述濃硫酸的添加量為體系總質量的1-2wt%，所述加熱回流反應的時間為3-5h；步驟s2中所述酸液為2-3wt%的乙酸或乳酸，所述殼聚糖、α-酮戊二酸、硼氫化鈉的質量比為10：14-17：3-5，所述加熱攪拌反應的溫度為35-40℃，時間為20-24h，所述攪拌反應的時間為10-12h；步驟s3中所述羧基化殼聚糖、月桂酸維生素c酯和濃硫酸的質量比為10:3-4:0.5-1，所述加熱回流反應的時間為4-6h。
12、本專利技術進一步保護一種上述前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒檢測前列腺病變組織的方法，包括以下步驟：
13、（1）制備細胞組織切片；
14、（2）將細胞組織切片進行抗原修復；
15、（3）將切片放入2-4wt%過氧化氫溶液中，室溫避光孵育10-20min，將玻片置于pbs溶液中在脫色搖床上晃動洗滌；
16、（4）切片干燥后，用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內滴加用封閉用正常山羊血清均勻覆蓋組織，室溫封閉25-35min；
17、（5）甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的一抗x，切片平放于避光濕盒內孵育；
18、（6）孵育多聚hrp二抗：玻片置于pbs溶液中在脫色搖床上晃動洗滌，切片干燥后在圈內滴加與一抗相應種屬的多聚hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育，pbs溶液洗滌；
19、（7）將熒光染料與tsa?buffer按照試劑盒的質量比例混合均勻，制得tsa熒光染料反應液，滴加至切片，均勻覆蓋組織室溫反應5-10min，pbs溶液洗滌；
20、（8）石蠟切片置于抗原修復液中或抗體洗脫液覆蓋樣本，36-38℃反應5-20min，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本，36-38℃反應5-20min，棄洗脫液，pbs溶液洗滌；
21、（9）用另一種熒光染料重復步驟（2）至步驟（8）進行第二輪標記；
22、（10）用另一種熒光染料重復步驟（2）至步驟（8）進行第三輪標記；
23、（11）將玻片置于pbs溶液中在脫色搖床上晃動洗滌，切片干燥后在圈內滴加dapi染液，避光室溫孵育5min-20min；
24、（12）將玻片置于pbs溶液中在脫色搖床上晃動洗滌，切片干燥后用抗熒光淬滅封片劑封片；
25、（13）將切片于成像系統下觀察并采集圖像，分析結果。
26、作為本專利技術的進一步改進，步驟（2）中所述抗原修復的方法包括：10-15mpa壓力下1-2min，再37℃水煮15min，或者90-100℃水浴15-25min，或者微波爐內中火5-10min，停火5-10min，轉中低火4-8min。
27、作為本專利技術的進一步改進，步驟（5）中所述孵育為4℃孵育過夜或37℃溫度下加熱處理1-2h。
28、作為本專利技術的進一步改進，所述一抗x為一抗p504s、一抗p63或一抗ck，所述多聚hrp二抗為多聚hrp本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，由以下原料按重量份制備而成：TYR-xxxPlus熒光染料40-60份、TSA?Buffer?30-45份、Polymer-HRP單抗鼠/兔二抗20-40份、抗體15-30份、Dapi染液5-15份、抗體稀釋液50-70份、過氧化酶封閉液50-70份；
2.根據權利要求1所述的前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述TYR-xxxPlus熒光染料選自TYR-480Plus熒光染料、TYR-520Plus熒光染料、TYR-570Plus熒光染料、TYR-620Plus熒光染料、TYR-690Plus熒光染料、TYR-780Plus熒光染料中的任意三種；所述抗體包括一抗P504S、一抗P63、一抗CK，質量比為10:12-15:10。
3.根據權利要求1所述的前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述表面活性劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種。
4.根據權利要求1所述的前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，步驟S1中所述濃硫酸的
5.一種使用權利要求1-4任一項所述前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒檢測前列腺病變組織的方法，其特征在于，包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，步驟（2）中所述抗原修復的方法包括：10-15MPa壓力下1-2min，再37℃水煮15min，或者37℃水浴15-25min，或者微波爐內中火5-10min，停火5-10min，轉中低火4-8min。
7.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，步驟（5）中所述孵育為4℃孵育過夜或37℃溫度下加熱處理1-2h。
8.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述一抗X為一抗P504S、一抗P63或一抗CK，所述多聚HRP二抗為多聚HRP山羊抗鼠/兔通用二抗，為即用型AFIHC001。
...【技術特征摘要】
1.一種前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，由以下原料按重量份制備而成：tyr-xxxplus熒光染料40-60份、tsa?buffer?30-45份、polymer-hrp單抗鼠/兔二抗20-40份、抗體15-30份、dapi染液5-15份、抗體稀釋液50-70份、過氧化酶封閉液50-70份；
2.根據權利要求1所述的前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述tyr-xxxplus熒光染料選自tyr-480plus熒光染料、tyr-520plus熒光染料、tyr-570plus熒光染料、tyr-620plus熒光染料、tyr-690plus熒光染料、tyr-780plus熒光染料中的任意三種；所述抗體包括一抗p504s、一抗p63、一抗ck，質量比為10:12-15:10。
3.根據權利要求1所述的前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述表面活性劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種。
4.根據權利要求1所述的前列腺病變組織免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于，步驟s...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳恙，王金佩，孫卓，
申請(專利權)人：湖南艾方生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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