【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種人源(homo?sapiens)潛在抗腫瘤靶點parp-2催化域的改造突變體蛋白，屬于基因技術和藥學領域。
技術介紹
1、parp催化腺苷二磷酸核糖基化(adenosine?diphosphate(adp)–ribosylation)，是細胞生命過程中一種重要的調控方式，包括從染色質的轉錄到蛋白質的翻譯和穩定性。parp以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)作為底物，將adp核糖共價連接到靶蛋白的絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸等殘基。已報道的人源parp蛋白有17種亞型，目前，研究最廣泛的亞型是parp-1和parp-2，抑制二者不僅能夠抑制損傷dna的修復，克服腫瘤的耐藥性和增加化療/放療的敏感性，也能通過與brca1/2的“合成致死”調控機制在臨床中用于brca1/2突變的卵巢癌和乳腺癌的治療。目前有六個藥物上市，奧拉帕尼(olaparib,2014)、魯卡帕尼(rucaparib,2016)、尼拉帕尼(niraparib,2017)、他拉唑帕尼(talazoparib,2018)、氟唑帕利(fluzoparib,2020)和帕米帕利(pamiparib,2021)，均為parp-1/2雙靶點抑制劑。
2、然而，越來越多的研究表明，parp-2在參與dna修復過程中，發揮著與parp-1不同的作用。例如：原子力顯微鏡(atomic?force?microscopy,afm)成像的實驗結果顯示，parp-1可與單鏈斷裂和雙鏈斷裂的dna結合，而parp-2對單鏈斷裂dna的結合具有更強的特異性，另外
3、多項研究表明：parp-2可通過多重途徑影響癌癥的發生和發展，如基因組不穩定性、細胞新陳代謝紊亂、血管生成、炎癥反應、腫瘤侵潤和免疫逃避，但其中很多機制和細節尚不明確；近年來的研究表明，前列腺癌組織中的parp-2表達高于良性前列腺組織，選擇性阻斷parp-2與foxa1相互作用，可有效抑制雄激素受體介導的前列腺癌的發展。
4、總的來說，parp-1和parp-2在生物學功能上存在差異，尤其是parp-2在腫瘤發生發展中發揮著獨特的作用，因此，發現parp-2選擇性抑制劑，不僅可進一步深入闡明parp-2在腫瘤發生發展中的功能，而且有可能發現更為安全有效的抗腫瘤藥物。
5、然而，parp-2表達量低和在4℃蛋白結晶兩個特點，一直都是parp-2抑制劑開發工作的障礙。表達量低，意味著獲得足量的蛋白需要花費更長的時間和(或)更多的物料，使得酶學水平抑制劑活性評價和結晶實驗的成本升高；4℃蛋白結晶需要特殊的低溫實驗室/環境才能完成。因此，提高parp-2的表達量以及令parp-2可在常溫結晶，對于parp-2選擇性和非選擇性抑制劑，甚至parp家族其它亞型的選擇性抑制劑設計，具有非常重要的意義。
技術實現思路
1、為了讓parp-2表達量更高和能夠在更接近室溫的環境形成晶體，本專利技術提供了parp-2的催化域蛋白的突變體。相比于野生型，該突變蛋白增強了熱穩定性，tm值提高約1.11℃，在escherichia?coli系統中高效表達，蛋白表達量相較密碼子優化之前提高四倍以上，并且可以在16-25℃獲得蛋白晶體。
2、為實現本專利技術的目的，本專利技術提供了如下技術方案：
3、本專利技術技術方案的第一方面是提供了一種人源parp-2催化域突變體蛋白，其特征在于，所述的人源parp-2催化域是野生型parp-2的全長氨基酸序列中的催化域部分，所述的人源parp-2催化域突變體蛋白是將人源parp-2催化域的氨基酸序列突變形成的突變體蛋白；所述的氨基酸序列突變是按照野生型parp-2的全長氨基酸序列349位至354位蘇氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸分別突變為絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸得到的氨基酸序列；所述的野生型parp-2的全長氨基酸序列如seq?idno.1所示，所述的野生型parp-2的催化域部分的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
4、所述的人源parp-2催化域突變體蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.6所示的序列。
5、本專利技術技術方案的第二方面是提供了一種編碼第一方面所述人源parp-2催化域突變體蛋白的核酸分子，其特征在于，所述人源parp-2催化域突變體蛋白的核酸分子的序列如seq?id?no.8所示。
6、還提供了一種編碼第一方面所述人源野生型parp-2催化域的核酸分子，其特征在于，所述人源野生型parp-2催化域的核酸分子針對e.coli進行密碼子優化，序列如seq?idno.4所示。
7、本專利技術技術方案的第三方面是提供了一種攜帶第二方面所述parp-2催化域突變體蛋白核酸分子的重組質粒。
8、還提供了一種攜帶第二方面所述野生型parp-2催化域核酸分子的重組質粒。
9、本專利技術技術方案的第四方面是提供了一種表達第一方面所述的人源parp-2催化域突變體蛋白的重組菌。
10、還提供了一種含有第二方面所述的人源parp-2催化域的核酸分子的重組菌。
11、所述的重組菌以大腸桿菌為宿主菌。
12、本專利技術技術方案的第五方面是提供了一種結晶第一方面所述的人源parp-2催化域突變體蛋白的方法，其特征在于，該蛋白可在16-25℃獲得蛋白晶體。
13、本專利技術技術方案的第六方面是提供了一種第一方面所述的人源parp-2催化域突變體蛋白在篩選parp-2抑制劑或其它parp亞型選擇性抑制劑中的應用，其特征在于，利用所述的parp-2催化域突變體蛋白進行酶學水平抑制劑活性評價。
14、還提供了一種第一方面所述的人源parp-2催化域突變體蛋白在培養化合物和parp-2催化域突變體蛋白復合物晶體中的應用，其特征在于，培養parp-2催化域突變體蛋白和抑制劑分子復合物晶體，指導基于蛋白結構的parp-2選擇性或非選擇性抑制劑設計。
15、本專利技術的有益效果是：
16、本專利技術提供一種突變改造的parp-2催化域突變體蛋白catparp-2se(349telqsp354突變為349serqgl354)，相比于野生型，tm值提高約1.11℃，該突變體蛋白熱穩定性更優良，并且在e.coli系統中高效表達，相較于密碼子未優化的野生型，表達量提高四倍以上，令獲得蛋白花費的時間和物料成本顯著降低，有利于開展酶學水平抑制劑活性評價和蛋白結晶實驗。培養該突變體的蛋白質晶體時，發現結晶溫度從4℃提高到了25℃，使得結晶實驗對設備/實驗環境的要求和控溫所需能耗顯著降低。catparp-2se突變體的發現，令parp抑制本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種人源PARP-2催化域突變體蛋白，其特征在于，所述的人源PARP-2催化域是野生型PARP-2的全長氨基酸序列中的催化域部分，所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白是將人源PARP-2催化域的氨基酸序列突變形成的突變體蛋白；所述的氨基酸序列突變是按照野生型PARP-2的全長氨基酸序列349位至354位蘇氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸分別突變為絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸得到的氨基酸序列；所述的野生型PARP-2的全長氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的野生型PARP-2的催化域部分的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.根據權利要求1所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白，其特征在于，所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示的序列。
3.一種編碼權利要求1-2任一項所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如SEQ?ID?NO.8所示。
4.一種編碼權利要求1中的人源PARP-2催化域的核酸分子，其特征在于
5.一種攜帶權利要求3所述核酸分子的重組質粒。
6.一種攜帶權利要求4所述核酸分子的重組質粒。
7.一種表達權利要求1-2任一項所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白的重組菌。
8.一種含有權利要求4所述的人源PARP-2催化域核酸分子的重組菌。
9.根據權利要求7-8任一項所述的重組菌，其特征在于，所述的重組菌以大腸桿菌為宿主菌。
10.一種結晶權利要求1-2任一項所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白的方法，其特征在于，該蛋白可在16-25℃獲得蛋白晶體。
11.一種權利要求1-2任一項所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白在篩選PARP-2抑制劑或其它PARP亞型選擇性抑制劑中的應用，其特征在于，利用所述的PARP-2催化域突變體蛋白進行酶學水平抑制劑活性評價。
12.一種權利要求1所述的人源PARP-2催化域突變體蛋白在培養化合物和PARP-2催化域突變體蛋白復合物晶體中的應用，其特征在于，培養PARP-2催化域突變體蛋白和抑制劑分子復合物晶體，指導基于蛋白結構的PARP-2選擇性或非選擇性抑制劑設計。
...【技術特征摘要】
1.一種人源parp-2催化域突變體蛋白，其特征在于，所述的人源parp-2催化域是野生型parp-2的全長氨基酸序列中的催化域部分，所述的人源parp-2催化域突變體蛋白是將人源parp-2催化域的氨基酸序列突變形成的突變體蛋白；所述的氨基酸序列突變是按照野生型parp-2的全長氨基酸序列349位至354位蘇氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸分別突變為絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸得到的氨基酸序列；所述的野生型parp-2的全長氨基酸序列如seq?id?no.1所示，所述的野生型parp-2的催化域部分的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
2.根據權利要求1所述的人源parp-2催化域突變體蛋白，其特征在于，所述的人源parp-2催化域突變體蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.6所示的序列。
3.一種編碼權利要求1-2任一項所述的人源parp-2催化域突變體蛋白的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如seq?id?no.8所示。
4.一種編碼權利要求1中的人源parp-2催化域的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如seq?id?n...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉宇，周潔，徐柏玲，
申請(專利權)人：中國醫學科學院藥物研究所，
類型：發明
國別省市：
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