【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及濕地松分子標記及遺傳育種。具體涉及一種與濕地松松脂產量相關的dna片段、其緊密連鎖的分子標記及其應用。
技術介紹
1、濕地松(pinus?elliottii?engelm.var.elliottii)原產于美國東南部，在我國引種栽培已經100多年，是我國南方重要的速生用材樹種和綠色化工原料松脂生產樹種，也是優良的松材線蟲病抗性樹種。松脂是松樹次生木質部和韌皮部導管中分泌的自身防御物質，也是人類大規模使用的最重要的天然產物之一，可用于生產重要的工業化學品松香和松節油。我國現有濕地松面積已達2200多萬畝，松脂年產量約60萬噸，占全球60％的油樹脂總量和50％的油樹脂貿易量，僅初級原料松脂產值達20億元以上。但目前松脂生產主要依靠大面積采出，樹脂單產率較低，僅有不到10％的企業建立了經遺傳改良的濕地松高產脂人工林，而且多數人工林盈利能力低下，嚴重影響了我國松脂產業的持續健康發展。
2、選育高產(松脂)質優的濕地松優良樹種是世界松脂產業健康發展的基礎和保障。一直以來，以選擇和雜交育種為主要手段的濕地松育種工作取得了長足的進展，然而濕地松巨大且保守的基因組和漫長的生命周期嚴重阻礙了其常規育種的效率，優良家系和單株選育緩慢，遠遠不能滿足松脂產業發展的需求，這已成為限制松脂產業發展的重要因素之一。
3、相比于傳統育種技術，分子標記輔助育種可從苗期進行早期選擇，大幅度縮短育種周期，對以木材和松脂為主要目的松樹育種優勢尤為明顯。分子標記輔助育種依賴于有效的分子標記，因此，開發與濕地松松脂產量相關的分子標記，
技術實現思路
1、為此，本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種與濕地松松脂產量相關的dna片段、其緊密連鎖的分子標記及其應用。本專利技術提供的snp分子標記能夠用于鑒出高產脂量濕地松，有助于提高濕地松育種的選擇效率，加快濕地松育種進程。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供如下技術方案：
3、一種與濕地松松脂產量相關的dna片段，所述dna片段的堿基序列如seq?id?no.1所示，所述dna片段為濕地松松脂產量調控基因peerf的全長轉錄組序列。
4、snp分子標記，所述snp分子標記位于上述的濕地松松脂產量相關的dna片段的第529位，所述snp分子標記的參考堿基為t，突變后堿基為c。
5、snp分子標記的應用，所述snp分子標記為上述的snp分子標記，所述應用為用于鑒定濕地松的產脂量表型、或者用于預測濕地松產脂量的高低、或者用于濕地松產脂量的改良、或者用于濕地松的分子標記輔助育種。
6、上述的snp分子標記的應用，鑒定濕地松的產脂量表型或者預測濕地松產脂量的高低時，從待測濕地松的基因組dna中獲取待測濕地松在seq?id?no.1所示序列的第529位處的基因型，當所述基因型為ct時，待測濕地松為高產脂量個體，當所述基因型為tt時，待測濕地松為低產脂量個體。
7、上述的snp分子標記的應用，從待測濕地松的基因組dna中獲取待測濕地松在seqid?no.1所示序列的第529位處的基因型時，以待測濕地松的基因組dna為模板dna進行pcr，獲得pcr產物，對pcr產物進行純化后，測序，得到待測濕地松在seq?id?no.1所示序列的第529位處的基因型。
8、上述的snp分子標記的應用，對待測濕地松的基因組dna進行pcr時，使用的pcr反應體系的體積為50μl，所述pcr反應體系中含有taq酶0.25μl、10×pcr?buffer?5μl、dntp混合液4μl、模板dna?200ng、f引物和r引物；所述pcr反應體系中，f引物和r引物的濃度均為0.2～1.0μmol/l。
9、上述的snp分子標記的應用，f引物和r引物的序列分別如seq?id?no.2和seq?idno.3所示。
10、上述的snp分子標記的應用，pcr時的反應程序為：94～95℃預變性3～5min；94～95℃變性15～30s，60～65℃退火和延伸40～60s，30～35個循環；65～70℃徹底延伸4～6min。
11、上述的snp分子標記的應用，pcr時的反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性15s，60℃退火和延伸50s，30個循環；60℃徹底延伸4min。
12、上述的snp分子標記的應用，對pcr產物進行純化時，依次進行瓊脂糖凝膠電泳和切膠純化，其中，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，使用瓊脂糖濃度為1.2wt％的瓊脂糖凝膠。
13、本專利技術所述的產脂量為采脂24小時內收集到的松脂質量，單位為克。
14、本專利技術提供的濕地松松脂產量基因位點及與所述基因位點緊密連鎖的分子標記的開發是基于已建立的濕地松半同胞家系群體，開展松脂產量表型的全基因組關聯分析鑒定出來的。濕地松木質部全長轉錄本為本專利技術snp分子標記開發的區域。
15、本專利技術采用兩步法pcr擴增濕地松基因片段，主要優勢在于時間上的高效性、對高熔點引物的適應性以及相對簡化的反應過程。而三步法雖然能夠較好地控制每一步的反應條件，但其耗時較長、過程復雜且對溫度控制要求較高，在實際操作中往往效率相對較低。
16、根據濕地松基因組中上述snp位點處的基因型，可較為準確地鑒定出濕地松的產脂量表型，即判斷出濕地松個體是高產脂量個體還是低產脂量個體，實現高產脂濕地松的早期選擇，提高育種效率。
17、從待測濕地松的基因組dna中獲取待測濕地松在seq?id?no.1所示序列的第529位處的基因型，即對seq?id?no.1所示序列的第529位處的snp分子標記所處位點的基因型進行檢測。檢測時，可以使用常見的snp檢測方法，如突變擴增阻滯系統pcr(arms?pcr)、taqman探針、分子信標和測序的方法等。
18、本專利技術的技術方案取得了如下有益的技術效果：
19、本專利技術在濕地松遺傳改良領域取得了顯著突破，其核心貢獻在于精準定位了一個對產脂性狀具有顯著影響的主效基因位點，該位點對濕地松產脂表型的貢獻率達到了14.1％，這一發現為濕地松高產育種奠定了堅實的遺傳學基礎。進一步地，本專利技術創新性地開發了與該主效基因位點緊密連鎖的snp(單核苷酸多態性)標記，這一技術工具的出現，極大地提升了濕地松高產育種的精準性與效率。
20、將該snp分子標記應用于240個母本自由授粉所得f1代群體中的240株濕地松分型結果表明：在高產脂基因型單株中，高達78.13％的個體其產脂量顯著超越了群體平均水平(19.71g)，而在低產脂基因型個體中，則有78.41％的個體產脂量明顯低于該平均值。這一實證數據充分驗證了該snp分子標記在輔助選擇高產脂濕地松單株中的高度有效性和可靠性，為快速篩選高產本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種與濕地松松脂產量相關的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的堿基序列如SEQID?NO.1所示，所述DNA片段為濕地松松脂產量調控基因PeERF的全長轉錄組序列。
2.SNP分子標記，其特征在于，所述SNP分子標記位于如權利要求1所述的濕地松松脂產量相關的DNA片段的第529位，所述SNP分子標記的參考堿基為T，突變后堿基為C。
3.SNP分子標記的應用，其特征在于，所述SNP分子標記為如權利要求2所述的SNP分子標記，所述應用為用于鑒定濕地松的產脂量表型、或者用于預測濕地松產脂量的高低、或者用于濕地松產脂量的改良、或者用于濕地松的分子標記輔助育種。
4.根據權利要求3所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，鑒定濕地松的產脂量表型或者預測濕地松產脂量的高低時，從待測濕地松的基因組DNA中獲取待測濕地松在SEQ?IDNO.1所示序列的第529位處的基因型，當所述基因型為CT時，待測濕地松為高產脂量個體，當所述基因型為TT時，待測濕地松為低產脂量個體。
5.根據權利要求4所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，從待測濕地松的基
6.根據權利要求5所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，對待測濕地松的基因組DNA進行PCR時，使用的PCR反應體系的體積為50μL，所述PCR反應體系中含有Taq酶0.25μL、10×PCR?Buffer?5μL、dNTP混合液4μL、模板DNA?200ng、F引物和R引物；所述PCR反應體系中，F引物和R引物的濃度均為0.2～1.0μmo?l/L。
7.根據權利要求6所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，F引物和R引物的序列分別如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。
8.根據權利要求7所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，PCR時的反應程序為：94～95℃預變性3～5min；94～95℃變性15～30s，60～65℃退火和延伸40～60s，30～35個循環；65～70℃徹底延伸4～6min。
9.根據權利要求8所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，PCR時的反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性15s，60℃退火和延伸50s，30個循環；60℃徹底延伸4min。
10.根據權利要求5所述的SNP分子標記的應用，其特征在于，對PCR產物進行純化時，依次進行瓊脂糖凝膠電泳和切膠純化，其中，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，使用瓊脂糖濃度為1.2wt％的瓊脂糖凝膠。
...【技術特征摘要】
1.一種與濕地松松脂產量相關的dna片段，其特征在于，所述dna片段的堿基序列如seqid?no.1所示，所述dna片段為濕地松松脂產量調控基因peerf的全長轉錄組序列。
2.snp分子標記，其特征在于，所述snp分子標記位于如權利要求1所述的濕地松松脂產量相關的dna片段的第529位，所述snp分子標記的參考堿基為t，突變后堿基為c。
3.snp分子標記的應用，其特征在于，所述snp分子標記為如權利要求2所述的snp分子標記，所述應用為用于鑒定濕地松的產脂量表型、或者用于預測濕地松產脂量的高低、或者用于濕地松產脂量的改良、或者用于濕地松的分子標記輔助育種。
4.根據權利要求3所述的snp分子標記的應用，其特征在于，鑒定濕地松的產脂量表型或者預測濕地松產脂量的高低時，從待測濕地松的基因組dna中獲取待測濕地松在seq?idno.1所示序列的第529位處的基因型，當所述基因型為ct時，待測濕地松為高產脂量個體，當所述基因型為tt時，待測濕地松為低產脂量個體。
5.根據權利要求4所述的snp分子標記的應用，其特征在于，從待測濕地松的基因組dna中獲取待測濕地松在seq?id?no.1所示序列的第529位處的基因型時，以待測濕地松的基因組dna為模板dna進行pcr，獲得pcr產物，對pcr產物進行純化后，測序，得到待測濕地松在seq?id?...
【專利技術屬性】
技術研發人員：欒啟福，丁顯印，刁姝，姜景民，
申請(專利權)人：中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，
類型：發明
國別省市：
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