【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于靶向敲除雞pparγ基因的sgrna及其載體和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、雞不僅是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，還是發(fā)育生物學(xué)和免疫學(xué)等研究的一個(gè)重要?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｔ诂F(xiàn)在肉雞產(chǎn)業(yè)中，由于長期的遺傳選擇，肉雞的生長速度和產(chǎn)肉量都得到顯著提高，但隨之而來是肉雞出現(xiàn)脂肪過度蓄積，特別是腹部脂肪過多蓄積。脂肪過度蓄積會(huì)導(dǎo)致雞的飼料轉(zhuǎn)化效率下降，肉品質(zhì)降低，養(yǎng)雞企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益減少，消費(fèi)者購買欲下降等。因此，了解肉雞脂肪生成和脂肪生長發(fā)育的分子機(jī)制，減少腹部脂肪過度沉積，創(chuàng)制低脂肉雞新品種已成為肉雞種業(yè)發(fā)展的目標(biāo)之一。
2、pparγ基因位于雞12號(hào)染色體上，編碼兩個(gè)蛋白異構(gòu)體(pparγ1和pparγ2)，是目前已知脂肪生成最重要的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。體外功能分析發(fā)現(xiàn)pparγ在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，在成纖維細(xì)胞或肌細(xì)胞中過表達(dá)pparγ能促進(jìn)這兩種細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。在3t3-l1脂肪細(xì)胞中，沉默pparγ會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞去分化和脂質(zhì)減少以及成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)下降。體內(nèi)研究表明，完全敲除pparγ后會(huì)導(dǎo)致鼠胎盤功能障礙和胚胎致死。為了研究pparγ在脂肪生成中的作用，人們構(gòu)建了脂肪特異性pparγ敲除小鼠。脂肪組織特異性pparγ敲除鼠仍可形成脂肪組織，但小鼠白色脂肪和棕色脂肪降低，脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)減少，脂肪和肝臟中脂肪墊大小減少并產(chǎn)生胰島素抵抗。我們前期研究發(fā)現(xiàn)雞pparγ基因在脂肪生成中也發(fā)揮重要作用，過表達(dá)pparγ能夠抑制雞前脂肪細(xì)胞的增殖，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化；敲除pparγ基因
3、目前，隨著基因功能和調(diào)控研究的深入，人們已經(jīng)意識(shí)到簡(jiǎn)單的基因敲除無法精確解析基因功能、基因互作以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而是需要建立組織和細(xì)胞特異性基因敲除、可誘導(dǎo)性敲除，以及基因特異標(biāo)記(示蹤)、精準(zhǔn)堿基替換或刪除等技術(shù)。crispr/cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于indel以及基因敲入等突變體的制備。crispr/cas9主要有兩種敲入方法，分別是非同源末端連接(non-homologous?end?joining，nhej)和同源重組(homology-directed?repair，hdr)方法。hdr修復(fù)途徑主要發(fā)生在細(xì)胞周期的s期和g2期，nhej修復(fù)發(fā)生在細(xì)胞周期所有階段，因此，nhej方法整合效率明顯高于hdr。hiti(homology-independent?targeted?integration)方法是一種nhej介導(dǎo)的整合方法，整合效率高，通過在供體載體兩端加入與靶向位點(diǎn)反向的向?qū)grna切割位點(diǎn)以此實(shí)現(xiàn)體內(nèi)線性化，同時(shí)也大大降低反向整合事件，這種方法廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的基因敲除。目前靶向敲除雞pparγ基因的grna設(shè)計(jì)在第四外顯子，這種方法并沒有影響pparγ基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始，只是導(dǎo)致該基因內(nèi)部發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致pparγ基因最終只能表達(dá)其n端部分(1-186aa)。另一種是pparγ基因的大片段敲除方法，該方法效率低，且基因組大片段敲除會(huì)導(dǎo)致一些重要的基因組順式調(diào)控元件丟失，這會(huì)改變其他基因的表達(dá)調(diào)控和基因組穩(wěn)定性等。在這兩種雞pparγ基因敲除方法中，敲除細(xì)胞的篩選都非常繁瑣，需要采用pcr擴(kuò)增靶序列片段以及克隆測(cè)序才能鑒定出敲除細(xì)胞，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于以上不足之處，本專利技術(shù)提供一種用于靶向敲除雞pparγ基因的sgrna及其載體和應(yīng)用。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)具體是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于靶向敲除雞pparγ基因的sgrna，所述的sgrna核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
3、進(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提供一種重組載體，所述的重組載體包含如上所述的sgrna。
4、進(jìn)一步的，所述的重組載體為cas9/grna載體。
5、進(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提供如上所述的sgrna或所述的重組載體在靶向敲除雞pparγ基因中的應(yīng)用。
6、本專利技術(shù)的另一目的是提供一種含有紅色熒光蛋白標(biāo)記的雞pparγ基因突變細(xì)胞株的構(gòu)建方法，本方法利用crispr/cas9系統(tǒng)靶向敲入紅色熒光蛋白mcherry的同時(shí)使pparγ基因敲除，進(jìn)而可通過觀察細(xì)胞是否表達(dá)紅色熒光來檢測(cè)細(xì)胞是否編輯成功，為后續(xù)pparγ基因編輯細(xì)胞的檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用，構(gòu)建方法步驟如下：
7、s1、根據(jù)靶向敲除雞pparγ基因的sgrna序列，設(shè)計(jì)一條反向互補(bǔ)核苷酸鏈并將二者混合退火形成雙鏈，所述的sgrna核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
8、s2、將所述的雙鏈與家禽cas9/grna載體連接，得到重組載體；
9、s3、以mcherry-puro質(zhì)粒為模板，利用引物組hiti-f/r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所述的引物組hiti-f/r的核苷酸序列分別如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后與peasy-blunt載體連接，得到供體載體；
10、s4、將所述的重組載體和供體載體共轉(zhuǎn)染雞源細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、篩選、鑒定，得到含有紅色熒光標(biāo)記的雞pparγ基因敲除的細(xì)胞株。
11、進(jìn)一步的，如上所述的步驟s4中通過紅色熒光進(jìn)行流式細(xì)胞儀篩選。
12、進(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提供通過如上所述的構(gòu)建方法得到的一種含有紅色熒光標(biāo)記的雞pparγ基因敲除的細(xì)胞株。
13、進(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提供如上所述的一種細(xì)胞株在制備基因編輯雞時(shí)對(duì)pparγ基因敲除細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記或示蹤的應(yīng)用。
14、本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：本專利技術(shù)的grna設(shè)計(jì)在第二外顯子，由于基因組中插入了報(bào)告基因，因此既可以使pparγ敲除，也不易導(dǎo)致產(chǎn)生其它新蛋白，基因編輯效率為75.4％，并且本專利技術(shù)利用crispr/cas9系統(tǒng)靶向敲入mcherry(紅色熒光蛋白)的同時(shí)使pparγ基因敲除，從而可通過觀察細(xì)胞是否表達(dá)紅色熒光來檢測(cè)細(xì)胞是否編輯成功，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因或細(xì)胞的特異標(biāo)記；本專利技術(shù)具有節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用的優(yōu)點(diǎn)，為深入研究pparγ基因在雞脂肪生成和脂肪生長發(fā)育中的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步解析肉雞腹脂沉積的遺傳機(jī)制和優(yōu)質(zhì)低脂肉雞的分子育種。
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1.一種用于靶向敲除雞PPARγ基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
2.一種重組載體，其特征在于，所述的載體包含如權(quán)利要求1所述的sgRNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體為cas9/gRNA載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的sgRNA或權(quán)利要求2或3所述的重組載體在靶向敲除雞PPARγ基因中的應(yīng)用。
5.一種含有紅色熒光標(biāo)記的雞PPARγ基因突變細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種含有紅色熒光標(biāo)記的雞PPARγ基因突變細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S4中通過紅色熒光進(jìn)行流式細(xì)胞儀篩選。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的構(gòu)建方法得到的一種含有紅色熒光標(biāo)記的雞PPARγ基因沉默的細(xì)胞株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種細(xì)胞株在制備基因編輯雞時(shí)對(duì)PPARγ基因敲除細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記或示蹤的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于靶向敲除雞pparγ基因的sgrna，其特征在于，所述的sgrna核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種重組載體，其特征在于，所述的載體包含如權(quán)利要求1所述的sgrna。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體為cas9/grna載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的sgrna或權(quán)利要求2或3所述的重組載體在靶向敲除雞pparγ基因中的應(yīng)用。
5.一種含有紅色...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：景洋，牟芳，邢曉旭，王寧，李輝，徐海冬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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