【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、母乳為嬰兒早期發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性因子，世界衛(wèi)生組織建議在出生后的前6個(gè)月進(jìn)行純母乳喂養(yǎng)。母乳成分包括營(yíng)養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)，生物活性成分：免疫球蛋白和激素等。近年國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究熱點(diǎn)集中在對(duì)母乳中宏量營(yíng)養(yǎng)成分及生物活性成分的研究，多為單純測(cè)定母乳中營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性成分的含量，具有所需樣本量大、所需試劑多、分析時(shí)間長(zhǎng)且無法獲得全部代謝物信息等缺點(diǎn)，并不能從整體上反映母乳小分子代謝物的變化。此外，目前多局限于人類母乳相關(guān)研究，與人類生理具有高度相似性的大鼠中乳汁成分研究甚少。鑒于此，本專利技術(shù)給出了一種基于uplc-q-exactive/ms技術(shù)分析大鼠乳汁代謝物的方法，可以全面檢測(cè)和分析乳汁樣本中的主要代謝產(chǎn)物，對(duì)于尚無法直接使用母乳開展的研究工作具有重要參考意義和價(jià)值。
2、因產(chǎn)時(shí)用力，勞則氣耗，產(chǎn)程中失血，氣隨血脫，進(jìn)而導(dǎo)致的氣血雙虛即為產(chǎn)后體虛，臨床常表現(xiàn)為亡血傷津及元?dú)馓潛p所致產(chǎn)婦產(chǎn)后乳汁不足、血暈、腹痛、發(fā)熱、惡露不絕和自汗等。驢膠補(bǔ)血顆粒組成包括阿膠、黃芪、黨參、熟地黃、白術(shù)和當(dāng)歸，其功效為滋陰補(bǔ)血、健脾益氣、調(diào)經(jīng)活血，是臨床治療月經(jīng)過少、產(chǎn)后失血等婦科疾病的經(jīng)典藥物。鑒于此，本專利技術(shù)將uplc-q-exactive/ms技術(shù)分析大鼠乳汁代謝物的方法應(yīng)用于驢膠補(bǔ)血顆粒改善產(chǎn)后體虛模型大鼠后乳汁成分變化的研究，可以全面了
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決所述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，該方法研究驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛代謝物的影響，尋找可能的生物標(biāo)志物，探討驢膠補(bǔ)血顆粒治療產(chǎn)后體虛的作用機(jī)制。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，所述方法包括：
4、(s1)產(chǎn)后體虛大鼠模型復(fù)制：將產(chǎn)后大鼠分成空白組、產(chǎn)后體虛模型組和驢膠補(bǔ)血顆粒干預(yù)組三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，產(chǎn)后體虛模型組和驢膠補(bǔ)血顆粒干預(yù)組大鼠每日通過負(fù)重力竭游泳和放血復(fù)制產(chǎn)后體虛大鼠模型，空白組正常飼養(yǎng)，造模14天后驢膠補(bǔ)血顆粒干預(yù)組大鼠每日灌喂驢膠補(bǔ)血顆粒進(jìn)行干預(yù)，空白組和產(chǎn)后體虛模型組大鼠均給予等量生理鹽水，給藥14天；
5、(s2)大鼠哺乳期結(jié)束后，分別采集且制備三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠的乳汁樣本，采用uplc-q-exactive/ms技術(shù)檢測(cè)，獲得三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠乳汁樣本的代謝物圖譜信息；
6、(s3)對(duì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的代謝物圖譜信息進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，篩選有顯著性差異的代謝物；
7、(s4)分析步驟(s3)獲得的差異代謝物之間的關(guān)系以及參與的代謝通路，探討驢膠補(bǔ)血顆粒治療產(chǎn)后體虛的作用機(jī)制。
8、所述步驟(s2)中，大鼠乳汁樣本制備包括以下步驟：
9、(1)取大鼠乳汁置于離心管中，將體積比為2:2:1的甲醇：乙腈：水加入乳汁樣本中渦旋30s，并在水浴中于4℃超聲處理，在4℃下離心，取上清液，在4℃蒸發(fā)至干，將干燥的樣品保存在-80℃下；
10、(2)用體積比為1:1的乙腈：水復(fù)溶干燥樣品，渦旋30s，在水浴中于4℃超聲處理，將上清液過膜備用。
11、進(jìn)一步的，所述步驟(s2)中，大鼠乳汁樣本制備包括以下步驟：
12、(1)取50μl大鼠乳汁樣本置于2ml離心管中，將250μl體積比為2:2:1的甲醇：乙腈：水加入乳汁樣本中渦旋30s，并在水浴中于4℃超聲處理5min，在13000rpm和4℃下離心15min，取上清液，用真空濃縮器在4℃蒸發(fā)至干，將干燥的樣品保存在-80℃下；
13、(2)用150μl體積比為1:1的乙腈：水復(fù)溶干燥樣品，渦旋30s，在水浴中于4℃超聲處理10min，將上清液過膜放入lc樣品瓶中并儲(chǔ)存在4℃進(jìn)行uplc-q-exactive/ms分析。
14、所述步驟s2中，超高效液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)條件為：色譜柱為waters,acquity?uplc?behamide?column,1.7μm,2.1mm?x?100mm，流動(dòng)相a為純水(含10mm乙酸銨和0.1％氨水的的緩沖鹽溶液)、流動(dòng)相b為乙腈，柱溫為40℃，進(jìn)樣室溫度為4℃，進(jìn)樣量為2μl，流速為0.3ml/min，梯度洗脫，液相色譜梯度洗脫程序?yàn)?-0.5min，5％a；0.5～9min，5％～30％a；9～11min，30％a；11～13min，30％～60％a；13～13.5min，60％～5％a；13.5～16min，5％a。
15、q-exactive/ms質(zhì)譜條件：離子源采用esi并在正負(fù)離子切換采集模式下進(jìn)行檢測(cè)full?scan/dd-ms2，鞘氣＝35arb，輔助氣體＝10arb，噴霧電壓(+)＝3.5kv，噴霧電壓(-)＝2.5kv，毛細(xì)管溫度＝320℃，輔助氣體加熱器溫度＝300℃，掃描范圍＝60～900(m/z)；最大注入時(shí)間＝120ms；自動(dòng)增益控制(agc)＝1e6?ions，ms?full?scan35000?fwhm，ms/ms17500fwhm，nce為12.5ev，25ev和37.5ev。
16、本專利技術(shù)還提供上述基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法在分析乳汁代謝物中的應(yīng)用，為相關(guān)藥物對(duì)乳汁代謝物的影響提供研究方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)創(chuàng)造的技術(shù)效果體現(xiàn)在：
17、(1)本專利技術(shù)采用uplc-q-exactive/ms技術(shù)分析大鼠乳汁代謝物，對(duì)乳汁成分進(jìn)行表征，可以全面檢測(cè)和分析乳汁樣本中的所有代謝物。
18、(2)本專利技術(shù)的應(yīng)用研究，在驢膠補(bǔ)血顆粒改善實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)后體虛狀態(tài)的同時(shí)，通過檢測(cè)不同分組間內(nèi)源性代謝物的變化分析驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)大鼠乳汁成分的影響，為探究臨床產(chǎn)后體虛患者服用驢膠補(bǔ)血顆粒后對(duì)乳汁成分的影響提供基礎(chǔ)，為臨床產(chǎn)后體虛患者的合理安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。
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1.一種基于UPLC-Q-Exactive/MS的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于UPLC-Q-Exactive/MS的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(S2)中，大鼠乳汁樣本制備包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于UPLC-Q-Exactive/MS的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(S2)中，大鼠乳汁樣本制備包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于UPLC-Q-Exactive/MS的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟S2中，UPLC色譜條件：色譜柱為Waters,ACQUITY?UPLC?BEH?Amide?Column,1.7μm,2.1mm?X?100mm，流動(dòng)相A為純水(含10mM乙酸銨和0.1％氨水的的緩沖鹽溶液)、流動(dòng)相B為乙腈，柱溫為40℃，進(jìn)樣室溫度為4℃，進(jìn)樣量為2μl，流速為0.3ml/min，梯度洗脫。
<...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(s2)中，大鼠乳汁樣本制備包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟(s2)中，大鼠乳汁樣本制備包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于uplc-q-exactive/ms的驢膠補(bǔ)血顆粒對(duì)產(chǎn)后體虛的治療機(jī)制代謝組學(xué)分析方法，其特征在于，所述步驟s2中，uplc色譜條件：色譜柱為waters,acquity?uplc?beh?amide?column,1.7μm,2.1mm?x?100mm，流動(dòng)相a為純水(含10mm乙酸銨和0.1％氨水的的緩沖鹽溶液)、流動(dòng)相b為乙腈，柱溫為40℃，進(jìn)樣室溫度為4℃，進(jìn)樣量為2μl，流速為0.3ml/min，梯度洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐向平，陳曉翌，顏冬蘭，田俊生，黃勝，胡麗彬，唐夢(mèng)香，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：九芝堂股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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