【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫學領域，具體涉及一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗及其抗原制備方法。
技術介紹
1、幽門螺桿菌(helicobacter?pylori，hp)是一種革蘭陰性、螺桿狀、微需氧菌，可以在胃、黏膜和十二指腸上皮持續存在。1982年澳大利亞學者marshall和warren首次報道了從慢性胃炎和胃潰瘍患者的胃黏膜中分離出幽門螺旋桿菌，是目前所知能夠在人胃中生存的唯一微生物種類。已有大量研究證實，hp是胃腸道疾病的常見病原體，是慢性b型胃炎、胃和十二指腸潰瘍的主要病因。hp也是胃腸癌、胃黏膜淋巴組織淋巴癌的關鍵病因，通過對細胞內信號的調控引起胃上皮細胞的遺傳不穩定，影響dna損傷修復系統，促進了胃上皮細胞的腫瘤轉化[i]。1994年國際癌癥研究中心就將其列為首要i類胃癌的致癌因子[ii]。2017年世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單顯示，幽門螺桿菌屬于i類致癌物，可誘發胃癌和淋巴增生性胃淋巴瘤等腫瘤。
2、hp感染在全世界各地人群中感染率均較高，全球感染率超過50％，主要集中在非洲和巴西等發展中國家，而歐洲、日本和韓國等發達國家地區感染率則相對較低。中國hp感染超過6億，每年因胃癌死亡者可達20萬人。目前抗生素治療hp感染雖有一定積極的臨床意義但仍存在明顯不足：1)毒副作用；2)易產生耐藥菌株；3)費用高；4)療程長，患者順應性差；5)療效不穩定等。疫苗是控制感染性疾病最為經濟有效的辦法，因此通過hp疫苗刺激機體產生針對幽門螺桿菌的特異性免疫應答，可以達到預防或者治療hp感染的目的。由于hp大規模培養
3、hp能在胃內定植是其致病的前提，而粘附則是定植的關鍵。hp僅定植于胃上皮及食管和十二指腸的上皮區域，說明這種粘附作用是由特異的粘附素-受體介導的。已知n-乙酰神經氨酰乳糖結合原纖維樣血凝素(nlbh，hpaa)是hp的主要粘附素之一，它能與多種胃上皮細胞表面受體包括神經節苷脂gm3、硫酸腦苷脂(slc)及層粘蛋白上的涎酸乳糖成分結合，使hp緊密粘附于胃上皮細胞，阻斷hp的粘附顯然可以防治hp感染。
4、人體黏膜免疫系統(human?mucosal?immune?system，hmis)主要由彌散分布于呼吸道、生殖泌尿道及消化道等處的黏膜及黏膜下的淋巴細胞構成，是人體最大的一個器官，其表面積大于皮膚表面積。其中，腸道黏膜是人體最主要的黏膜部位。人類腸道具有約400cm2的表面積。在腸道黏膜系統中，存在著獨特的淋巴組織以及其他大量的淋巴細胞，其通過其固有免疫和后天性免疫識別并抵抗外來危險病原，從而維持機體免疫穩態。在腸道黏膜部位，由于存在豐富的免疫細胞，抗原通過免疫細胞的攝取和呈遞既能誘導全身的體液免疫和細胞免疫應答，如產生針對該抗原的抗體(主要是siga)和相應的細胞毒性t細胞(ctl)。同時，由于激活的抗原特異性淋巴細胞歸巢至遠程黏膜效應部位，也能誘導黏膜局部的免疫應答。因此腸黏膜免疫具有實現全身或局部免疫治療的巨大潛力。腸道黏膜疫苗接種也是目前認為防御腸道致病菌的唯一途徑。
5、細菌dna是toll樣受體9的天然配體，含有非甲基化cpg序列的合成寡聚脫氧核苷酸(odns)可以模擬細菌dna結構并引發類似的活性。cpg?odns可以觸發表達tlr9的免疫細胞(包括人漿細胞樣樹突細胞和b細胞)，產生th1免疫及其相關細胞因子為特征的固有免疫反應。cpg?odns用作疫苗佐劑時，可提高專職的抗原提呈細胞的功能，并促進抗原特異性的體液和細胞免疫反應。根據結構和生物功能，含cpg的序列可分為三大類：cpg-a類、cpg-b類和cpg-c類，其中cpg-b級分子是臨床疫苗研究中最常用的。cpg-odn的結構和功能密切相關。事實上，分子的高級結構決定了cpg-odn是在細胞內定位于早期還是晚期溶酶體，這些溶酶體與不同的信號通路相關。多聚體cpg-a?odn主要定位于早期溶酶體，在漿細胞樣樹突狀細胞中，它們導致ifn-α的強烈誘導。單體cpg-b?odns集中在晚期內體區室，可以促進漿細胞樣樹突狀細胞和b細胞的細胞成熟。cpg-c?odn定位于兩個區室，誘導ifn-α的產生和細胞成熟。影響含cpg序列生物效應的其他結構修飾包括通過非核苷化學連接體連接兩個或多個短的硫代磷酸酯骨架cpg?odn，以產生線性嵌合免疫調節化合物和/或含cpg納米顆粒化合物的制劑。1018是一種合成的cpg-b類寡核苷酸，具有硫代磷酸酯骨架和序列第一個cpg基序(下劃線)是對小鼠tlr-9有活性的序列，而第二個cpg基序(下劃雙線)對人類和非人靈長類tlr-9具有活性。cpg?1018已被用作heplisav-b(一種改良的hbv疫苗)的佐劑，可用于成人(年齡>18歲)。盡管還有其它hbv疫苗已被廣泛使用，但它們通常是以三劑方案給藥，而heplisav-b提供了一種兩劑方案。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗及其抗原制備方法，解決現有技術中口服重組蛋白疫苗耐受性低和抗原被稀釋、降解甚至變性失活的技術問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供了以下技術方案：
3、本專利技術提供的一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗，所述疫苗包括抗原和佐劑，所述抗原為hpaa，所述佐劑為cpg1018，所述hpaa的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。
4、本專利技術還提供一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，包括以下步驟：
5、s1、質粒構建，蛋白表達：將核苷酸序列如seq?id?no:2所示的hpaa的基因鏈接在表達載體中，構建好的表達載體轉入重組工程菌中進行誘導表達；
6、s2、發酵；
7、s3、純化；
8、s31、菌體重懸；將菌體與a液按照質量比1:15加入a液進行稀釋、重懸，至菌體均勻重懸于a液中；
9、s32、菌體破碎，離心過濾收集上清液；
10、s33、sp?ff層析：平衡2-3cv；上樣；復平衡3-5cv；b液，10cv洗脫收集洗脫峰，將洗脫峰用a液稀釋，cond＜6.0ms/cm，過濾收集濾液；
11、s34、sp?hp層析：平衡2-3cv；上樣；復平衡2-3cv；b液，10cv洗脫收集洗脫峰，洗脫峰稀釋，再與c液混合，上清過濾收集濾液；
12、s35、butyl?hp層析：d液平衡2-3cv；上樣；復平衡2-3cv；a液，10cv洗脫收集洗脫峰；
13、s36、濃縮換液、除菌過濾得到hpaa原液。
14、進一步的，所述s1中表達載體為pet-29b(+)，重組工程菌為pet-hpaa/bl21。
15、進一步的，所述s2包括以下子步驟：
16、s21、菌種開啟：pet29-hpaa本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.?一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗，其特征在于，所述疫苗包括抗原和佐劑，所述抗原為HpaA，所述佐劑為CpG1018，所述HpaA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
2.一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述S1中表達載體為pET-29b（+），重組工程菌為pET-HpaA/BL21。
4.根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述S2包括以下子步驟：
5.?根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述S21、S22、S24結束后取菌液樣品做純菌檢查和鏡檢，細菌為革蘭氏陰性桿菌，S21、S22、S23、S25結束后菌液OD600值分別為大于1.50、大于1.50、20.00、不超過1.00；所述S23菌液OD600在10.00時開始以0.015?L/分鐘補加甘油，直到誘導結束；所述S24誘導開始時以0.02?L/分鐘補加濃縮培養基
6.根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述S32具體為：將重懸的菌體進行剪切均質：2~8℃條件下均質，700-900Bar，3次；均質后的液體于12000g離心力下離心30min；收集上清，使用0.6-0.8μm深層濾板進行澄清過濾，再使用0.65μm濾芯進行澄清過濾。
7.?根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述S3中A液為20mM?PB，pH?6.0；B液為20mM?PB+1M?NaCl，pH?6.0；C液為20mM?PB+3M（NH4）2SO4，pH?6.0；D液為20mM?PB+1.5M(NH4)2SO4，pH?6.0。
8.?根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述S36為用10KDAA膜包進行超濾濃縮處理三步層析樣液，濃縮至原來體積的1/5-1，等體積補加E液，連續洗濾5-10個體積，透析結束濃縮樣品至三步層析樣品液體積的1/2-1；所述E液為20mM?PB+?5mM?L-Cys·Hcl?+?5%甘露醇，pH?8.0。
...【技術特征摘要】
1.?一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗，其特征在于，所述疫苗包括抗原和佐劑，所述抗原為hpaa，所述佐劑為cpg1018，所述hpaa的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。
2.一種幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述s1中表達載體為pet-29b（+），重組工程菌為pet-hpaa/bl21。
4.根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述s2包括以下子步驟：
5.?根據權利要求2所述的幽門螺桿菌口服重組蛋白疫苗的抗原的制備方法，其特征在于，所述s21、s22、s24結束后取菌液樣品做純菌檢查和鏡檢，細菌為革蘭氏陰性桿菌，s21、s22、s23、s25結束后菌液od600值分別為大于1.50、大于1.50、20.00、不超過1.00；所述s23菌液od600在10.00時開始以0.015?l/分鐘補加甘油，直到誘導結束；所述s24誘導開始時以0.02?l/分鐘補加濃縮培養基。
【專利技術屬性】
技術研發人員：李建霖，董重，漆熠，樊釩，稅靜，吳強，陳克平，李小璟，趙丹，張玲，王萌，孫巍，吳靜，
申請(專利權)人：成都歐林生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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