【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于農業生物，具體涉及西葫蘆wmv病毒病分子標記與鑒定西葫蘆wmv病毒病抗性的方法及應用。
技術介紹
1、西葫蘆(cucurbita?pepo?l.)是我國普遍種植的瓜類蔬菜，我國的種植面積、產量與消費量常年居世界首位。設施西葫蘆種植已成為農民增收、農業產業結構調整的重要創收作物。
2、西瓜花葉病毒病(watermelon?mosaic?virus，wmv)是目前危害西葫蘆等葫蘆科作物生產的主要病害之一。植株感染wmv后,葉片初期會產生沿脈綠帶和皰斑，嚴重后新葉蕨葉畸形、植株矮化，果實表面呈綠色斑駁、皺縮，果實失去商品價值，產量損失可達30％-50％，甚至絕收。wmv病毒在世界范圍內傳播蔓延迅速，在我國西葫蘆生產中的危害廣泛而嚴重(冀樹嫻等2020)。
3、目前還沒有防治wmv病毒病的有效試劑和措施，田間生產中主要依靠防治蚜蟲、及時拔除掩埋發病植株來降低病毒病的傳播與危害。培育和推廣抗病品種是減少病毒病危害最為經濟、安全、有效的措施。但目前，由于通過人工接種進行抗性鑒定存在操作繁瑣、性狀鑒定準確性差、易于雜染其它病毒致使選育中途選擇失敗等問題，導致wmv病毒病抗病性狀轉育困難，抗病育種效率低、周期長、易失敗等問題，生產上抗病品種少。與抗病基因緊密連鎖的分子標記可以提高選擇的準確性、加速抗病育種進程，在抗病育種中起到關鍵作用。因此，獲得與西葫蘆wmv病毒病抗病基因緊密連鎖的分子標記，對提高西葫蘆抗病育種效率，培育抗wmv病毒病新品種，保障西葫蘆產業的健康發展具有重要的實際應用價值。
>技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是如何鑒定西葫蘆的wmv病毒病抗性性狀。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種檢測待測西葫蘆基因組中是否含有序列表seq?id?no.1中第117-140位所示的dna片段的物質在如下任一種的應用：1)鑒定或輔助鑒定西葫蘆wmv病毒病抗性中的應用；2)鑒定或輔助鑒定wmv病毒病抗性性狀穩定遺傳西葫蘆中的應用；3)西葫蘆育種中的應用；4)選育抗西葫蘆wmv病毒西葫蘆；5)在制備鑒定或輔助鑒定西葫蘆wmv病毒病抗性性狀的試劑或試劑盒中的應用。
3、上述檢測待測西葫蘆基因組中是否含有序列表seq?id?no.1中第117-140位所示的dna片段的物質包括如下1)或2)：1)擴增待測西葫蘆基因組中是否含有序列表seq?idno.1中第117-140位所示的dna片段的引物對a1；2)含有所述引物對a1的試劑或試劑盒。
4、上述引物對a1由上游引物p1和下游引物p2組成，所述上游引物p1為與seq?idno.1的第117位上游特異結合的單鏈dna，所述下游引物p2為與seq?id?no.1的第140位下游特異結合的單鏈dna；進一步地，上游引物p1為seq?id?no.1的第1-25位所示的單鏈dna(即，seq?id?no.3所示的單鏈dna分子)，下游引物p2為與seq?id?no.1的第188-211位反向互補的單鏈dna(即，seq?id?no.4所示的dna分子)。
5、為解決上述技術問題，本專利技術還提供了西葫蘆wmv病毒病分子標記。
6、本專利技術所提供的西葫蘆wmv病毒病分子標記為引物對a1，標記為43772，所述引物對a1由名稱為p1和p2的單鏈dna組成，所述p1為與seq?id?no.1的第117位上游特異結合的單鏈dna，所述p2為與seq?id?no.1的第140位下游特異結合的單鏈dna。
7、上述西葫蘆分子標記中，所述p1可為seq?id?no.1的第1-25位所示的單鏈dna(即，seq?id?no.3所示的單鏈dna分子)，所述p2可為與seq?id?no.1的第188-211位反向互補的單鏈dna(即，seq?id?no.4所示的單鏈dna分子)。
8、上述分子標記43772是通過如下方法獲得的：以西葫蘆自交系‘bv5’和西葫蘆自交系‘bv49’分別作為抗病和感病親本配制f2代分離群體，用indel引物篩選與西葫蘆wmv病毒病顯性抗病基因cpwmv連鎖的分子標記，得到共顯性分子標記43772，該標記與抗病基因cpwmv的遺傳連鎖距離為0.1cm。
9、為解決上述技術問題，本專利技術還提供了鑒定或輔助鑒定西葫蘆wmv病毒病抗性性狀的方法。
10、本專利技術所提供的鑒定或輔助鑒定西葫蘆wmv病毒病抗性性狀的方法，為如下1)或2)：
11、1)包括如下m1)和m2)：
12、m1)以待測西葫蘆基因組dna為模板，采用所述引物對a1進行pcr擴增得到pcr產物；
13、m2)檢測步驟m1)得到的pcr產物，如果所述pcr產物含有一條不含有seq?id?no.1的第117-140位所示的dna片段和一條含有seq?id?no.1的第117-140位所示的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為抗wmv病毒病西葫蘆；如果所述pcr產物對應于seq?id?no.1為一條不含有seq?id?no.1的第117-140位所示的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為抗wmv病毒病西葫蘆；如果所述pcr產物對應于seq?id?no.1為一條含有seq?id?no.1的第117-140位所示的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為非抗wmv病毒病西葫蘆；
14、2)包括如下n1)和n2)：
15、n1)以待測西葫蘆基因組dna為模板，采用所述引物對a1進行pcr擴增得到pcr產物；
16、n2)如下n21)或n22)：
17、n21)檢測步驟n1)得到的pcr產物的大小，如果所述pcr產物含有211bp和187bp的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為抗wmv病毒病西葫蘆；如果所述pcr產物含有187bp的dna片段且不含211bp的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為抗wmv病毒病西葫蘆；如果所述pcr產物不含有187bp的dna片段且含有211bp的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為非抗wmv病毒病西葫蘆；
18、n22)檢測步驟n1)得到的pcr產物的序列，如果所述pcr產物含有seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為抗wmv病毒病西葫蘆；如果所述pcr產物含有seq?id?no.2所示的dna片段且不含seq?id?no.1所示的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為抗wmv病毒病西葫蘆；如果所述pcr產物含有seq?id?no.1所示的dna片段且不含seq?id?no.2所示的dna片段，所述待測西葫蘆為或候選為非抗wmv病毒病西葫蘆；所述分子標記為43722。
19、上述鑒定西葫蘆wmv病毒病抗性的方法中，進行所述pcr擴增的體系可含有：10×buffer，datp、dttp、dctp和dgtp濃度均為2.5mm的dntps，taq?dna聚合酶，所述p1，所述p2，待測西葫蘆基因組dna。所述體系中da本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.檢測待測西葫蘆基因組中是否含有序列表SEQ?ID?NO.1中第117-140位所示的DNA片段的物質在如下任一種的應用：
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述引物對由上游引物P1和下游引物P2組成，所述上游引物P1為與SEQ?ID?NO.1的第117位上游特異結合的單鏈DNA，所述下游引物P2為與SEQ?ID?NO.1的第140位下游特異結合的單鏈DNA；
4.一種鑒定或輔助鑒定西葫蘆WMV病毒病抗性的方法，其特征在于，為如下I或II：
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：
6.一種西葫蘆的育種方法，其特征在于，選取權利要求4中所述抗性西葫蘆作為親本進行育種。
7.鑒定或輔助鑒定西葫蘆WMV病毒病抗性性狀的引物對，為權利要求5所述的引物對。
8.如下1)-5)中任一物質：
9.下述H1-H7中任一應用：
10.一種鑒定或輔助鑒定抗WMV病毒病性狀穩定遺傳西葫蘆的方法，為如下I或II：
【技術特征摘要】
1.檢測待測西葫蘆基因組中是否含有序列表seq?id?no.1中第117-140位所示的dna片段的物質在如下任一種的應用：
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述引物對由上游引物p1和下游引物p2組成，所述上游引物p1為與seq?id?no.1的第117位上游特異結合的單鏈dna，所述下游引物p2為與seq?id?no.1的第140位下游特異結合的單鏈dna；
4.一種鑒定或輔助鑒定西葫蘆w...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張國裕，李海真，張帆，田佳星，賈長才，
申請(專利權)人：北京市農林科學院，
類型：發明
國別省市：
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