【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物催化，具體地說，涉及一種血紅素加氧酶突變體及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、膽綠素(biliverdin)，又稱去氫膽紅素，是一種線性四吡咯色素。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，衰老的紅細(xì)胞在單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的作用下，釋放出血紅蛋白，血紅蛋白隨后被分解成珠蛋白和血紅素。血紅素在血紅素加氧酶(heme?oxygenase)的作用下，將鐵卟啉環(huán)的α-亞甲基橋氧化斷裂形成膽綠素。隨后膽綠素進(jìn)一步被膽綠素還原酶(biliverdin?reductase)還原，生成膽紅素，由此可見膽綠素可以作為生產(chǎn)膽紅素的原料。
2、膽紅素是重要藥材牛黃的主要成分之一，還是中國藥典中記載的100多種中成藥制劑的主要成份，市場(chǎng)需求量巨大。目前膽紅素的生產(chǎn)方法主要有兩種：一是動(dòng)物藥源提取法，即從豬、牛等動(dòng)物的膽汁中提取膽紅素，這是目前市場(chǎng)上膽紅素的主要生產(chǎn)方法。但是天然膽紅素在動(dòng)物膽汁中的含量甚微，例如豬膽汁中膽紅素含量約為萬分之五，提取1公斤膽紅素至少需要5噸的豬膽，導(dǎo)致生產(chǎn)膽紅素的成本較高且不可持續(xù)。另一種方法是酶法合成，即利用膽綠素為原料通過酶法合成膽紅素，生物法具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
3、由于天然的膽綠素獲取比較困難，早期都是通過化學(xué)法直接合成，但是化學(xué)方法生產(chǎn)會(huì)引入膽綠素的多種同分異構(gòu)體，造成目標(biāo)產(chǎn)物純度不高，下游分離純化的難度很大。隨后，許多研究開始轉(zhuǎn)向利用酶法合成膽綠素，酶法是利用商業(yè)化的氯化血紅素為底物，在血紅素加氧酶的作用下，氧化生成膽綠素。由此合成的膽綠素可以作為原料進(jìn)一步制備膽
4、
5、2012年，美國猶他州立大學(xué)jon?y?takemoto從藍(lán)藻(synechocystis?pcc6803)克隆獲得一個(gè)血紅素加氧酶基因，將其成功在大腸桿菌表達(dá)，并用于體外生物轉(zhuǎn)化血紅素合成膽綠素，膽綠素的滴度僅達(dá)到23.5mg/l(bmc?biotechnology,2012:12:1-10)。專利文獻(xiàn)cn109182232a報(bào)道了一種能表達(dá)來源于集胞藻(synechocystis?sp.)血紅素加氧酶基因的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)后，在培養(yǎng)液中加入氯化血紅素作為底物，在胞內(nèi)血紅素加氧酶的催化作用下，用于生物轉(zhuǎn)化法制備膽綠素，最終轉(zhuǎn)化體系中的膽綠素產(chǎn)量可達(dá)61.7mg/l，氯化血紅素的摩爾轉(zhuǎn)化率為34.5％。專利cn114891711a報(bào)道了一種能表達(dá)破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(clostridium?tetani)來源的血紅素加氧酶的重組大腸桿菌，在其胞內(nèi)構(gòu)建了輔酶循環(huán)系統(tǒng)和膜表面展示系統(tǒng)，來增大血紅素加氧酶和底物血紅素之間的接觸，以提高轉(zhuǎn)化效率、縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)微生物法高效催化合成膽綠素，最終膽綠素產(chǎn)量達(dá)到76.3mg/l(生物工程學(xué)報(bào),2022,38:2581-2593)。專利文獻(xiàn)cn116676204a公開了一種重組酵母基因工程菌及其在生物轉(zhuǎn)化法合成膽綠素中的應(yīng)用，該重組酵母基因工程菌以巴斯德畢赤酵母為宿主菌，過表達(dá)擬南芥(arabidopsis?thaliana)來源的血紅素加氧酶，以該重組畢赤酵母基因工程菌為催化劑，以氯化血紅素為底物，生物轉(zhuǎn)化法合成膽綠素，膽綠素轉(zhuǎn)化得率可以達(dá)到132mg/l，是目前報(bào)道的生物法合成膽綠素的最高產(chǎn)量，然而轉(zhuǎn)化率僅為18.5％。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、我們對(duì)于上述現(xiàn)有技術(shù)的多種來源的血紅素加氧酶包括藍(lán)藻(synechocystispcc6803)、集胞藻(synechocystis?sp.)、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(clostridium?tetani)、擬南芥(arabidopsis?thaliana)等來源的血紅素加氧酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這些血紅素加氧酶在呈游離狀態(tài)催化氯化血紅素反應(yīng)合成膽綠素時(shí)，表現(xiàn)的氧化酶活力較低，適用的底物濃度很低，甚至不能高于0.3g/l，沒有實(shí)際應(yīng)用的可能性。
2、考慮到酶催化法即游離酶或固定化酶催化法具有反應(yīng)體系成分明晰、反應(yīng)條件容易控制、后處理工序簡單方便、產(chǎn)物容易分離純化等優(yōu)勢(shì)，我們重點(diǎn)研究了游離酶催化方法。為此對(duì)于眾多生物來源的血紅素加氧酶或同工酶進(jìn)行了廣泛調(diào)研，通過對(duì)六十多種來源血紅素加氧酶的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，篩選出氧化活力高、底物和產(chǎn)物耐受濃度高的血紅素加氧酶，發(fā)現(xiàn)一種棒狀桿菌corynebacterium?sp.來源的血紅素加氧酶(ncbi號(hào)：wp_014319205.1)是其中的佼佼者。進(jìn)一步地，為了提高其酶活力，我們還通過易錯(cuò)pcr的隨機(jī)突變方法對(duì)該酶進(jìn)行突變，還得到了一些酶活力進(jìn)一步提高的突變體。因此，本專利技術(shù)包括如下技術(shù)方案。
3、一種酶催化制備膽綠素的方法，包括如下步驟：
4、以氯化血紅素為底物，使用棒狀桿菌corynebacterium?sp.來源的血紅素加氧酶(氨基酸序列為seq?id?no:2，ncbi號(hào)：wp_014319205.1，本文中命名為coho)或者其酶活力提高的突變體催化氧化反應(yīng)，得到膽綠素。
5、mttataglavelkqstaqahekaehstfmsdllkgrlgvaeftrlqeqawlfytaleqavdavrasgfaeslldpalnraevlardldklngssewrsritaspavidyvnrleeirdnvdgpalvahhyvrylgdlsggqviarmmqrhygvdpealgfyhfegiaklkvykdeyreklnnlelsdeqrehllkeatdafvfnhqvfadlgkgl(seqid?no:2)。
6、該酶催化方法中，反應(yīng)體系中可以添加有葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和輔酶nadp+(β-煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，輔酶ii)或nad+(β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，即輔酶i)，以便促進(jìn)氧化反應(yīng)。
7、上述葡萄糖脫氫酶可以是常用的葡萄糖脫氫酶比如市售酶制劑，例如是來源于巨大芽孢桿菌bacillus?megaterium的葡萄糖脫氫酶(journal?of?biological?chemistry,1989,264:6381-6385)。
8、在一種實(shí)施方式中，上述血紅素加氧酶或者其突變體呈現(xiàn)為酶形式，比如為游離酶或者固定化酶。
9、可替代地，上述血紅素加氧酶或突變體也可以呈現(xiàn)為其表達(dá)微生物菌體形式。
10、上述反應(yīng)體系可以為緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖溶液，ph值可以為6.0-9.0，優(yōu)選ph7.0-8.5，例如為ph8.0左右；
11、反應(yīng)溫度可以為20-35℃，優(yōu)選25-32℃，例如為30℃左右。
12、例如，上述氧化反應(yīng)的條件可以為：底物氯化血紅素濃度為0.1～1g/l，葡萄糖用量為1～10g/l，催化量的血紅素加氧酶或其突變體，葡萄糖脫氫酶的用量為0.5～1.5g/l，nadp+用量為0.05～0.2mm，反應(yīng)液水相ph為6.0～9.0，反應(yīng)溫度為20～35℃，反應(yīng)過程中通入持續(xù)氧氣或空氣；所述的氧化反應(yīng)的時(shí)間以反應(yīng)轉(zhuǎn)化本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種酶催化制備膽綠素的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中添加有葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和輔酶NADP+或NAD+。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述血紅素加氧酶或者其突變體呈現(xiàn)為酶形式或者表達(dá)微生物菌體形式。
4.一種如權(quán)利要求1中所述的血紅素加氧酶突變體，其特征在于，所述突變體為氨基酸序列SEQ?ID?NO:2中的下述位點(diǎn)發(fā)生突變后所形成的突變體：第34位賴氨酸、第54位蘇氨酸、第60位纈氨酸、第93位絲氨酸、第101位蘇氨酸、第122位甘氨酸、第143位異亮氨酸、第167位丙氨酸、第178位谷氨酸、第199位天冬氨酸、或者它們中兩種以上的組合，該血紅素加氧酶突變體具有血紅素加氧酶SEQ?ID?NO:2的功能。
5.如權(quán)利要求4所述的血紅素加氧酶突變體，其特征在于，其為選自下述的多肽：
6.編碼如權(quán)利要求5中所述血紅素加氧酶突變體SEQ?ID?NO:3的基因。
7.如權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于，核苷酸序列為SEQ?ID?NO:4。
<...【技術(shù)特征摘要】
1.一種酶催化制備膽綠素的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中添加有葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和輔酶nadp+或nad+。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述血紅素加氧酶或者其突變體呈現(xiàn)為酶形式或者表達(dá)微生物菌體形式。
4.一種如權(quán)利要求1中所述的血紅素加氧酶突變體，其特征在于，所述突變體為氨基酸序列seq?id?no:2中的下述位點(diǎn)發(fā)生突變后所形成的突變體：第34位賴氨酸、第54位蘇氨酸、第60位纈氨酸、第93位絲氨酸、第101位蘇氨酸、第122位甘氨酸、第143位異亮氨酸、第167位丙氨酸、第178位谷氨酸、第199位天冬...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張仙，游智能，賀松，薛江濤，鄭明坤，戴憶思，葛麗蓉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海百福安生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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