【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于色譜檢測，具體涉及一種l-纈氨酸中雜質氨基酸的檢測方法。
技術介紹
1、l-纈氨酸是組成蛋白質的20種氨基酸之一，屬于支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，也是哺乳動物的必需氨基酸和生糖氨基酸，其能促進身體正常生長、修復組織、調節血糖，在食品/飼料添加劑、調味品、保健品、醫農藥等領域有著廣泛的應用。
2、高純纈氨酸的生產方法主要有：提取法、微生物發酵法、酶催化法和化學合成法。其中，生物發酵法生產纈氨酸成本較低、易大規模生產，是全球纈氨酸生產的主要方式。當前高純纈氨酸產能主要集中在日本，日本纈氨酸純度較高，達到99.3％以上，廣泛應用于醫藥領域，包括醫藥原料中間體的制造，如l-纈氨酸甲酯鹽酸鹽、l-纈氨酸乙酯鹽酸鹽、n-甲基-l-纈氨酸、n-乙酰-l-纈氨酸等。而我國高純纈氨酸生產存在雜酸高、發酵周期長、提取手段落后、產品純度低等問題，目前國產l-纈氨酸由于純度較低，多用在飼料等其他領域，醫藥領域需求的高純度纈氨酸仍舊依賴進口。
3、高純l-纈氨酸生產使用的原料是粗品l-纈氨酸，粗品中含有各種雜質氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等，高純-l纈氨酸對單個雜質氨基酸殘留要求≤0.02％，因此需要對高純l-纈氨酸生產中產生的雜氨基酸量進行嚴格控制。但是受氨基酸結構限制，多數氨基酸官能團對紫外吸收較弱，現有高效液相色譜-紫外檢測法的定量限很難滿足高純l-纈氨酸中雜酸殘留量的檢測要求。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種l-纈氨酸
2、為實現上述目的，本專利技術提供了一種l-纈氨酸中雜質氨基酸的檢測方法，其采用高效液相色譜法檢測，所用色譜柱為硅膠基c18反相色譜柱，流動相為磷酸鹽溶液和乙腈溶液的混合溶液。
3、優選地，所述色譜柱的規格為3.9x150mm，4μm；
4、所用檢測器為uv紫外檢測器，紫外檢測波長為330-350nm，具體可為340nm。
5、優選地，所述流動相流速為0.6-1.2ml/min，具體可為1.0ml/min。
6、優選地，流動相梯度洗脫程序如下：
7、
8、其中，流動相a為磷酸鹽溶液，流動相b為乙腈溶液。
9、柱溫為35-45℃，具體可為40℃；
10、進樣體積為20μl。
11、優選地，所述磷酸鹽溶液為0.05mol/l磷酸氫二鈉緩沖液。
12、優選地，所述乙腈溶液為70％-90％乙腈水溶液。
13、在本專利技術的一種實施方式中，所述檢測方法包括下述步驟：
14、1)配制高純l-纈氨酸中待測雜質氨基酸的混合標準溶液，柱前衍生化后進樣檢測，得出濃度-色譜峰定量參數相關性；
15、2)在與步驟1)相同的檢測條件下檢測待測樣品溶液的色譜峰定量參數，基于濃度-色譜峰定量參數相關性，得到待測樣品中各雜質氨基酸的殘留量。
16、優選地，所述柱前衍生的方法為：在緩沖溶液條件下，將高純l-纈氨酸中待測雜質氨基酸的混合標準溶液或待測樣品溶液與opa衍生試劑發生衍生化反應；
17、所述待測雜質氨基酸為谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸。
18、在本專利技術的一種實施方式中，所述檢測方法包括下述步驟：
19、1)配制谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合標準溶液，采用opa柱前衍生化后進樣檢測，在色譜圖中分別找出谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸的峰面積；
20、2)配制待測樣品溶液，并按照步驟1)柱前衍生后進樣檢測，在其色譜圖中分別找出待測樣品溶液中谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸對應的峰，通過外標法計算各雜質氨基酸的殘留量。
21、進一步地，所述柱前衍生的方法為：在緩沖溶液條件下，將谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合標準溶液或待測樣品溶液與opa衍生試劑發生衍生化反應。
22、優選地，所述緩沖溶液為硼酸緩沖液，所述硼酸緩沖液的ph為10-10.2。
23、優選地，步驟1)中，所述谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合標準溶液中，谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸的濃度均為0.0005g/l；
24、所述谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸混合標準溶液與硼酸緩沖液、opa衍生試劑的體積比可為5：6：4。
25、本專利技術的有益效果在于：本專利技術開發了一種通過硅膠基c18反相色譜柱及特定流動相和洗脫程序分離測定高純l-纈氨酸中雜質氨基酸殘留的方法，該方法檢測信噪比高，理論塔板數高，定量限低至0.01-0.04μg/ml，滿足對單個雜質氨基酸殘留要求≤0.02％的檢測要求。
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1.一種L-纈氨酸中雜質氨基酸的檢測方法，其特征在于，其采用高效液相色譜法檢測，所用色譜柱為硅膠基C18反相色譜柱，流動相為磷酸鹽溶液和乙腈溶液的混合溶液。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述色譜柱的規格為3.9x150mm，
3.根據權利要求1-2任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述流動相流速為0.6-1.2mL/min。
4.根據權利要求1-3任一項所述的檢測方法，其特征在于，流動相梯度洗脫程序如下：
5.根據權利要求1-4任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述色譜柱柱溫為35-45℃。
6.根據權利要求1-5任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液為0.05mol/L磷酸氫二鈉緩沖液。
7.根據權利要求1-6任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述乙腈溶液為70％-90％乙腈水溶液。
8.根據權利要求1-7任一項所述的檢測方法，其特征在于，包括下述步驟：
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述柱前衍生的方法為：在緩沖溶液條件下，將高純L-纈氨酸
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述緩沖溶液為硼酸緩沖液，所述硼酸緩沖液的pH為10-10.2。
...【技術特征摘要】
1.一種l-纈氨酸中雜質氨基酸的檢測方法，其特征在于，其采用高效液相色譜法檢測，所用色譜柱為硅膠基c18反相色譜柱，流動相為磷酸鹽溶液和乙腈溶液的混合溶液。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述色譜柱的規格為3.9x150mm，
3.根據權利要求1-2任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述流動相流速為0.6-1.2ml/min。
4.根據權利要求1-3任一項所述的檢測方法，其特征在于，流動相梯度洗脫程序如下：
5.根據權利要求1-4任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述色譜柱柱溫為35-45℃。
6.根據權利要求1-5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡兆鋒，汪艷，劉安興，張貝貝，
申請(專利權)人：安徽華恒生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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