【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于微生物，具體地說，是關(guān)于一種用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的耐高滲菌株的適應(yīng)性進化方法、獲得的耐高滲菌株及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、丁二酸又名琥珀酸，是一種重要的c4平臺化合物，在食品、化工、農(nóng)業(yè)和制藥行業(yè)有著重要的應(yīng)用。琥珀酸過去通常通過基于石油的化學法生產(chǎn)，包括石蠟氧化和加氫、馬來酸或馬來酸酐的電解還原等方式。在資源短缺、氣候變化和環(huán)境污染等問題愈發(fā)凸顯的當代，化學法特別是石油化工與可持續(xù)、綠色環(huán)保和碳中和等概念背道而馳。因此，采用更加綠色環(huán)保，資源節(jié)約可持續(xù)地方法生產(chǎn)琥珀酸愈發(fā)受到關(guān)注和青睞。而與石油化工相對的生物發(fā)酵法，由于可利用自然資源廣泛、更加的環(huán)境友好、高轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵效率等特點，有望在未來替代化學法生產(chǎn)琥珀酸。
2、琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間體，同時也作為厭氧代謝的終產(chǎn)物之一，幾乎在所有的動物、植物和微生物細胞中都有合成。其中，細菌和真菌被認為是能夠高效生產(chǎn)琥珀酸的宿主。釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、黑曲霉(aspergillus?niger)、煙曲霉(aspergillus?fumigatus)、熱帶假絲酵母(candida?tropicalis)和畢赤酵母(pichiakudriavzevii)等真菌都已經(jīng)被開發(fā)用于琥珀酸生產(chǎn)。細菌屬如大腸桿菌(escherichiacoli)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、琥珀酸放線菌(actinobacillussuccinogenes)、曼氏產(chǎn)琥珀酸桿菌(mannheimia?succinici
3、還原三羧酸(rtca)途徑是厭氧條件下琥珀酸產(chǎn)生的主要途徑。磷酸烯醇式丙酮酸(pep)可以通過pep羧化酶或pep羧激酶(pck)轉(zhuǎn)化為草酰乙酸(oaa)，然后通過蘋果酸脫氫酶(mdh)、富馬酸酶(fum)和富馬酸還原酶(frd)將胞質(zhì)中的草酰乙酸還原為琥珀酸。
4、以大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，主要采用雙階段發(fā)酵方法生產(chǎn)琥珀酸。雙階段即第一階段為好氧階段，通過好氧培養(yǎng)使得菌體快速達到較高的生物量，第二階段即為生產(chǎn)琥珀酸的厭氧階段。由于厭氧階段有大量琥珀酸的產(chǎn)生，因此需要不斷流加大量堿中和劑如na2co3、naoh等，以此中和體系中產(chǎn)生的琥珀酸，維持發(fā)酵體系的ph在合理范圍。但隨著發(fā)酵的進行，大量堿液的流加導(dǎo)致發(fā)酵體系中滲透壓顯著增加，進而影響工程菌產(chǎn)琥珀酸的能力，因此發(fā)酵后期高滲透壓環(huán)境是大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸的一大阻礙因素。所以針對產(chǎn)琥珀酸工程菌耐高滲性能的提高對于大腸肝菌雙階段產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量提升有著重大意義。
5、目前針對琥珀酸生產(chǎn)菌株耐高滲能力提升的研究較少，且主要通過物理誘變篩選以及在發(fā)酵過程中添加半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸甜菜堿等滲透壓保護劑來提高生產(chǎn)菌株對高滲環(huán)境的耐受性。這些方法具有操作繁雜、篩選困難以及成本較高的缺點。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、鑒于目前丁二酸生物合成領(lǐng)域?qū)Ω邼B透壓環(huán)境具有高耐受性底盤菌株的缺乏，以及現(xiàn)有的提高丁二酸生產(chǎn)菌株耐高滲能力方法的缺點和不足，本專利技術(shù)致力于使用一種新的提高丁二酸生產(chǎn)菌株耐高滲性能的方法，以選育出新的耐高滲透壓的丁二酸高產(chǎn)底盤菌株。
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的第一個方面，提供了一種用于生產(chǎn)丁二酸的耐高滲菌株的適應(yīng)性進化方法，包括以下步驟：
3、s1：將出發(fā)菌株接種于添加了適當濃度乙酸鈉的一級進化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其od600達到3～4時，轉(zhuǎn)移至新鮮的一級進化培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
4、s2：當進化菌株在一級進化培養(yǎng)基中能夠穩(wěn)定快速生長時，提高進化培養(yǎng)基中乙酸鈉的濃度，并重復(fù)s1的操作，直至獲得能夠耐受所需濃度乙酸鈉的進化菌株；
5、s3：將s2獲得的耐乙酸鈉進化菌株接種于添加適當濃度乙酸鈉和氯化鈉的二級進化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其od600達到3～4時，轉(zhuǎn)移至新鮮的二級進化培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
6、s4：當進化菌株在二級進化培養(yǎng)基中能夠穩(wěn)定快速生長時，進一步提高進化培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度，并重復(fù)s3的操作，直至獲得能夠耐受所需濃度的乙酸鈉和氯化鈉的耐高滲菌株。
7、根據(jù)本專利技術(shù)的優(yōu)選實施例，所述出發(fā)菌株為大腸桿菌afp111。
8、進一步的，所述一級進化培養(yǎng)基是在m9培養(yǎng)基中添加濃度為5g/l～20g/l的乙酸鈉；所述二級進化培養(yǎng)基是在m9培養(yǎng)基中添加10g/l的乙酸鈉的基礎(chǔ)上，進一步添加濃度為10g/l～20g/l的氯化鈉。
9、本專利技術(shù)的第二個方面，提供了根據(jù)上述的適應(yīng)性進化方法獲得的耐高滲菌株。
10、優(yōu)選的，所述耐高滲菌株為大腸桿菌escherichia?coli?zzt215，其保藏號為cctccno:m?2024239。
11、本專利技術(shù)的第三個方面，提供了上述的耐高滲菌株用于通過雙階段發(fā)酵方法生產(chǎn)丁二酸的應(yīng)用。
12、進一步的，所述雙階段發(fā)酵包括：
13、第一階段的好氧階段，通過好氧培養(yǎng)使得菌體快速達到較高的生物量；以及
14、第二階段的厭氧階段，生產(chǎn)丁二酸。
15、本專利技術(shù)的第四個方面，提供了一種雙階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，使用上述的耐高滲菌株進行發(fā)酵。
16、進一步的，所述雙階段發(fā)酵包括：
17、第一階段的好氧階段，通過好氧培養(yǎng)使得菌體快速達到較高的生物量；以及
18、第二階段的厭氧階段，生產(chǎn)丁二酸。
19、根據(jù)本專利技術(shù)的優(yōu)選實施例，所述雙階段發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為：na2hpo4·12h2o3.78g/l，kh2po4?0.75g/l，nacl?0.5g/l，nh4cl?5g/l，cacl2?0.011g/l，微量元素混合液0.1ml/l，1％vb1?0.2ml/l，mgso4·7h2o?0.5g/l，葡萄糖50g/l；其中，微量元素混合液的組成為：alcl3·6h2o?10g/l，na2moo4·2h2o?2g/l，mnso4?10g/l，znso4·7h2o?2g/l，cucl2·2h2o?1g/l。
20、并且，厭氧發(fā)酵過程中補加葡萄糖，使其濃度控制在20～50g/l。
21、本專利技術(shù)具有以下有益效果：
22、1、本專利技術(shù)獲得的進化菌株大腸桿菌escherichia?coli?zzt215能夠在含10g/l乙酸鈉和20g/l氯化鈉的無機鹽培養(yǎng)基中良好生長，24h好氧生長od600達到3左右。
23、2、本專利技術(shù)獲得對的耐高滲透壓進化菌株——大腸桿菌zzt215可用于搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，在厭氧階段初始添加60g/l琥珀酸鈉模擬高滲條件下，相較原始菌株，丁二酸產(chǎn)量提高約50％。
24、3、本專利技術(shù)的耐高滲菌株的適應(yīng)性進化方法，成功應(yīng)用于大腸桿菌雙階段發(fā)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種用于生產(chǎn)丁二酸的耐高滲菌株的適應(yīng)性進化方法，其特征在于包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)性進化方法，其特征在于，所述出發(fā)菌株為大腸桿菌AFP111。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)性進化方法，其特征在于，所述一級進化培養(yǎng)基是在M9培養(yǎng)基中添加濃度為5g/L～20g/L的乙酸鈉；所述二級進化培養(yǎng)基是在M9培養(yǎng)基中添加10g/L的乙酸鈉的基礎(chǔ)上，進一步添加濃度為10g/L～20g/L的氯化鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的適應(yīng)性進化方法獲得的耐高滲菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐高滲菌株，其特征在于，所述耐高滲菌株為大腸桿菌Escherichia?coli?ZZT215，其保藏號為CCTCC?NO:M?2024239。
6.權(quán)利要求4或5所述的耐高滲菌株的應(yīng)用，其特征在于，用于通過雙階段發(fā)酵方法生產(chǎn)丁二酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述雙階段發(fā)酵包括：
8.一種雙階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求4或5所述的耐高滲菌株進行發(fā)酵。
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【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于生產(chǎn)丁二酸的耐高滲菌株的適應(yīng)性進化方法，其特征在于包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)性進化方法，其特征在于，所述出發(fā)菌株為大腸桿菌afp111。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適應(yīng)性進化方法，其特征在于，所述一級進化培養(yǎng)基是在m9培養(yǎng)基中添加濃度為5g/l～20g/l的乙酸鈉；所述二級進化培養(yǎng)基是在m9培養(yǎng)基中添加10g/l的乙酸鈉的基礎(chǔ)上，進一步添加濃度為10g/l～20g/l的氯化鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的適應(yīng)性進化方法獲得的耐高滲菌株。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳輝，朱政同，羅遠嬋，
申請(專利權(quán))人：華東理工大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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