【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物材料，尤其涉及一種仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞及其制備方法和應用。
技術(shù)介紹
1、器官移植是治療終末期器官功能衰竭的重要手段之一。然而，排斥反應是器官移植患者術(shù)后移植物損失的主要原因。雖然fk506(他克莫司)或環(huán)孢素a(csa)等免疫抑制藥物通常用于緩解移植排斥反應，但長期全身應用這些藥物可能導致嚴重的并發(fā)癥，如嚴重感染、惡性腫瘤、高血壓、腎毒性等，從而影響移植患者的長期生存和生活質(zhì)量。因此，迫切需要創(chuàng)新的治療方法來解決免疫排斥問題，而不需要長期的全身免疫抑制。
2、免疫檢查點是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，對于維持免疫系統(tǒng)的自我耐受和防止過度的自身免疫反應至關重要。抑制檢查點分子，尤其是被廣泛研究的程序性細胞死亡配體1/程序性細胞死亡1(pd-l1/pd-1)負性共刺激通路，在抑制t細胞活化和保持外周耐受性方面發(fā)揮著至關重要的作用。最近的研究表明，增強pd-1/pd-l1的相互作用可以減輕心臟、胰島和角膜移植中的免疫失調(diào)，以及同種異體移植物的免疫破壞。例如cheng等人設計了高表達pd-l1的細胞膜源性納米囊泡(nvs)，增強了pd-l1/pd-1免疫抑制通路，誘導同種異體移植物免疫耐受，從而延長了小鼠皮膚和心臟移植的存活時間。同樣，也制備了過表達fgl1/pd-l1的間充質(zhì)干細胞衍生的小細胞外囊泡(sev)來減輕免疫排斥。盡管有這些令人鼓舞的進展，但細胞膜來源的nvs和間充質(zhì)干細胞來源的sev通常都是非特異性的，不能充分靶向地遷移到移植物中，全身給藥容易引發(fā)非特異性免疫反應并導
3、巨噬細胞是參與移植免疫應答的主要細胞。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)大量巨噬細胞可以靶向遷移到同種異體移植物中，巨噬細胞的浸潤與同種異體移植物的排斥程度密切相關。此外，巨噬細胞還通過抗原加工和遞呈抗原對同種異體移植產(chǎn)生適應性同種免疫反應。特別是巨噬細胞中pd-l1的過表達能夠抑制cd8+細胞毒性t淋巴細胞的活化。因此，我們認為巨噬細胞高表達pd-l1極可能具有靶向移植物調(diào)節(jié)t細胞的免疫活性，進而達到有效抑制排斥反應的作用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問題，一種仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞及其制備方法和應用。本專利技術(shù)提供了一種經(jīng)仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的過表達pd-l1基因工程化巨噬細胞(mφpd-l1@ahg)：首先，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達pd-l1工程巨噬細胞(mφpd-l1)；然后，為了能夠追蹤工程巨噬細胞在體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)歸，構(gòu)建了仿生聚集誘導發(fā)光探針(ahg)；最后，用ahg標記mφpd-l1構(gòu)建mφpd-l1@ahg。經(jīng)靜脈給藥后，本專利技術(shù)中制備的mφpd-l1@ahg能夠靶向遷移到同種異體移植皮膚中，抑制t細胞活化與增殖，下調(diào)促炎細胞因子，增加調(diào)節(jié)性t細胞(treg)。
2、為達上述目的，本專利技術(shù)采用如下的技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了一種仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞的制備方法，包括以下步驟：
4、①熱酸堿法提取葡聚糖粒子(gps)；
5、②將步驟①制備的gps與具有聚集誘導發(fā)光效應的熒光分子(hbttpip)共孵育制備具有聚集誘導發(fā)光效應的仿生葡聚糖粒子探針(ahg)；
6、③巨噬細胞先孵育過夜，然后與pd-l1慢病毒共培養(yǎng)11～13h，接著加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育47～49h，隨后用含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)，當幾乎所有活細胞都表達熒光時，即構(gòu)建出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過表達pd-l1基因工程化巨噬細胞(mφpd-l1)；
7、④先將步驟③構(gòu)建的mφpd-l1孵育11～13h，然后與步驟②制備的ahg共孵育12～24h，即構(gòu)建獲得仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞(mφpd-l1@ahg)。
8、優(yōu)選的，所述步驟①的具體過程為：先將安琪酵母分散于naoh中75～85℃水浴0.5～1.5h，然后冷卻至室溫離心獲沉淀，接著將沉淀重懸在hcl溶液中55～65℃水浴0.5～1.5h，最后離心、洗滌、再離心，將得到的沉淀干燥即獲得所述gps。
9、優(yōu)選的，所述步驟②的具體過程為：先將gps混合于去離子水中，隨后加入hbttpip乙醇溶液，搖床孵育11～13h，離心收集沉淀，并用去離子水洗滌，即得到所述ahg。
10、進一步優(yōu)選的，所述gps與所述去離子水的混合方式為：9～11mg?gps混合于0.5～1.5ml去離子水中。
11、再優(yōu)選的，所述hbttpip乙醇溶液中hbttpip的濃度為0.5～1.5mm，hbttpip乙醇溶液的加入量為90～110μl。
12、優(yōu)選的，所述步驟③中pd-l1慢病毒的moi值為60。
13、優(yōu)選的，所述步驟③中嘌呤霉素在完全培養(yǎng)基中的濃度為2μg?ml-1。
14、優(yōu)選的，所述步驟④的具體過程為：將mφpd-l10.5～1.5×105接種于6孔板孵育12h后，在培養(yǎng)皿中加入0.5～1.5×107個ahg，再孵育2h，然后將細胞轉(zhuǎn)移入transwell上室，下室中加入含有8～12ngmcp-1的培養(yǎng)基，再孵育12h即可。
15、本專利技術(shù)還提供了一種使用所述制備方法制備的仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞。
16、本專利技術(shù)還提供了一種所述制備方法或所述仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞在免疫抑制檢測和/或治療產(chǎn)品制備中的應用。
17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下技術(shù)效果：
18、(1)本專利技術(shù)提供了一種經(jīng)仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的過表達pd-l1基因工程化巨噬細胞(mφpd-l1@ahg)：首先，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達pd-l1工程巨噬細胞(mφpd-l1)；然后，為了能夠追蹤工程巨噬細胞在體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)歸，構(gòu)建了仿生聚集誘導發(fā)光探針(ahg)；最后，用ahg標記mφpd-l1構(gòu)建mφpd-l1@ahg。
19、(2)經(jīng)靜脈給藥后，本專利技術(shù)中制備的mφpd-l1@ahg能夠靶向遷移到同種異體移植皮膚中，抑制t細胞活化與增殖，下調(diào)促炎細胞因子，增加調(diào)節(jié)性t細胞(treg)。
20、(3)本專利技術(shù)中制備的mφpd-l1@ahg不僅能夠可視化體外回輸巨噬細胞在體遷移至移植物，同時其自身以及聯(lián)合其他免疫抑制劑能夠有效抑制移植排斥反應，延長移植物的生存期。本專利技術(shù)在器官移植、自身免疫性疾病等的免疫抑制治療中意義重大。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一種仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的PD-L1基因工程化巨噬細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟①的具體過程為：先將安琪酵母分散于NaOH中75～85℃水浴0.5～1.5h，然后冷卻至室溫離心獲沉淀，接著將沉淀重懸在HCL溶液中55～65℃水浴0.5～1.5h，最后離心、洗滌、再離心，將得到的沉淀干燥即獲得所述GPs。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟②的具體過程為：先將GPs混合于去離子水中，隨后加入HBTTPIP乙醇溶液，搖床孵育11～13h，離心收集沉淀，并用去離子水洗滌，即得到所述AHG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述GPs與所述去離子水的混合方式為：9～11mg?GPs混合于0.5～1.5mL去離子水中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述HBTTPIP乙醇溶液中HBTTPIP的濃度為0.5～1.5mM，HBTTPIP乙醇溶液的加入量為90～110μL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟③中嘌呤霉素在完全培養(yǎng)基中的濃度為2μg?ml-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟④的具體過程為：將MΦPD-L10.5～1.5×105接種于6孔板孵育12h后，在培養(yǎng)皿中加入0.5～1.5×107個AHG，再孵育2h，然后將細胞轉(zhuǎn)移入Transwell上室，下室中加入含有8～12ng?MCP-1的培養(yǎng)基，再孵育12h即可。
9.使用權(quán)利要求1-8任一所述的制備方法制備的仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的PD-L1基因工程化巨噬細胞。
10.權(quán)利要求1-8任一所述的制備方法或權(quán)利要求9所述的仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的PD-L1基因工程化巨噬細胞在免疫抑制檢測和/或治療產(chǎn)品制備中的應用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種仿生聚集誘導發(fā)光探針標記的pd-l1基因工程化巨噬細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟①的具體過程為：先將安琪酵母分散于naoh中75～85℃水浴0.5～1.5h，然后冷卻至室溫離心獲沉淀，接著將沉淀重懸在hcl溶液中55～65℃水浴0.5～1.5h，最后離心、洗滌、再離心，將得到的沉淀干燥即獲得所述gps。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟②的具體過程為：先將gps混合于去離子水中，隨后加入hbttpip乙醇溶液，搖床孵育11～13h，離心收集沉淀，并用去離子水洗滌，即得到所述ahg。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述gps與所述去離子水的混合方式為：9～11mg?gps混合于0.5～1.5ml去離子水中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述hbttpip乙醇溶液中hbttpip的濃度為0.5～1...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張麗，王文淵，高瑭，謝明星，季翔，王一卉，王睿，王祿芳，何夢榮，朱業(yè)，張紫桑，靳巧鋒，李玉曼，周武祺，
申請(專利權(quán))人：華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。