血清中甘油三酯的兩步酶測定方法技術

本發明專利技術公開了一種血清中甘油三酯的兩步酶測定方法，屬于利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法。本發明專利技術的技術方案是：雙色原物質同在試劑Ｉ中，試劑ＩＩ僅有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為：血清先與試劑Ｉ于３７℃溫浴３～５分鐘，血清中游離甘油與試劑Ｉ反應生成醌亞胺，加入試劑ＩＩ后于３７℃溫浴４～７分鐘，甘油三酯水解后經反應產生紅色的醌亞胺。儀器在５００－５２０ｎｍ波長處檢測，以試劑Ｉ反應產生的醌亞胺為空白，由試劑ＩＩ反應產生的醌亞胺計算出甘油三酯的含量。本發明專利技術檢測時不受內源性甘油影響，其使用方法和范圍與原有兩步酶法相同，不增加試劑成本，經濟方便易行，是一種準確性更高的甘油三酯檢測方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于一種包含酶的測定方法；或是利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測。
技術介紹
血清中甘油三脂(TG)的測定方法一般可分為化學法、酶法和色譜法3大類。早期測定方法是以總脂質與膽固醇和磷脂之差估算。化學法用有機溶劑抽提標本中的TG，去除抽提液中磷脂等干擾物后，用堿水解(皂化)TG，以過碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用顯色反應測甲醛。比較準確的是二氯甲烷硅酸變色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干擾、變色酸顯色靈敏度高、顯色穩定，至今還是美國疾病控制與預防中心(CDC)的內部參考方法。但因操作步驟繁多、技術要求高而不適于臨床常規檢測工作中應用。色譜法包括核素稀釋/氣相色譜/質譜等方法(ID/GC/MS)，主要用作參考系統中決定性方法的建立及參考物質的制備與定值，此法費用昂貴，樣品處理復雜，難以推廣應用。另外應用高效液相色譜儀測定血清中的甘油三酯，檢測成本高，難以在臨床推廣。 目前國內幾乎所有的臨床實驗室都用酶法檢測血清TG水平，此方法分為一步法和兩步法，雖然方法各異，但一般都包括以下幾個基本反應步驟用最合適的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H2O2，在過氧化物酶(POD)的催化下，H2O2，4氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也有使用4-氯酚、苯酚的衍生物、苯胺鹽和苯磺酸鹽，下面就以2，4-二氯酚為代表敘述，其他色原不再重復提起，)形成有色染料(常為醌亞胺類)，這些物質的生成量與樣本中的甘油三酯含量成正比。最后通過分光光度法計算出相應的TG濃度。具體反應見化學反應式1～4。 生化分析儀檢測血清中TG采用的是酶法，一般采用LPL、GPO、POD、4-氨基安替比林和酚等試劑的方法(GPO-PAP法)。其一步法是將LPL、GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚、鎂鹽、表面活性劑及防腐劑等成分溶解在Tris-HCl緩沖液中配制成單一試劑。按中華醫學會推薦法配制Tris-HCl緩沖液每升內含有的主要成分有Tris0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯苯酚2.5mmol、MgSO4 10mmol、膽酸鈉3.5mmol、Triton X-1000.1g、ATP1.0mmol。GK500U、GPO3000U、POD1000U、LPL3000 U、4-氨基安替比林1.2mmol。此法具有簡便快速、微量、精密度高的優點，且特異性強，反應線性范圍寬，易達到終點。但由于血清中TG水解后產生的甘油以及血清中原有的游離甘油都參與了反應，所以用一步法測定的是血清總甘油酯(定義為TG和游離甘油及少量甘油二酯、甘油一酯之和，習慣統稱為TG)，使反應結果不能真實反映血清中TG的含量。中華醫學會檢驗分會于1995年推薦GPO-PAP法的兩步酶法作為血清TG常規測定方法。該方法是將原單一的反應試劑分成雙試劑，其中LPL和4-氨基安替比林組成試劑II，其余成分組成試劑I，希望能減少游離甘油的干擾。按中華醫學會推薦法配制，其試劑II每升Tris-HCl緩沖液內含有主要成分有Tris 0.15 mmol(pH7.6)、LPL30000U、4氨基安替比林1.0mmol。試劑I每升Tris-HCl緩沖液內含Tris 0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0 mmol、MgSO4 12mmol、膽酸鈉4.2mmol、Triton X-100 0.12g、ATP1.2mmol、GK 600 U、GPO 3600 U、POD1200 U。 國內大部分臨床實驗室采用一步酶法和兩步酶法檢測甘油三脂。國內一些試劑廠家生產兩步酶法的試劑盒是以GK、GPO、POD、2，4-二氯酚為試劑I，以LPL、4-氨基安替比林作為試劑II。也有的廠家以GK、GPO、2，4-二氯酚為試劑I，以LPL、4-氨基安替比林和POD作為試劑II。這些試劑盒既可以作為雙試劑使用，也可以將兩種試劑合在一起作為單試劑使用。中華醫學會推薦的兩步酶方法可以消除脂血、溶血、黃疽的干擾等優點，但在實際應用中也存在以下問題 現在所用以4-氨基安替比林和脂蛋白脂肪酶組分為試劑II的兩步酶方法中，在加入試劑？后的第一步預孵育期，游離甘油轉化為無色的2，4-二氯酚的二聚體和苯氧自由基，見反應式5。在加入試劑？后，血清中的甘油三酯在脂蛋白脂肪酶的催化下經過化學反應式(1)～(4)的反應最終轉化為紅色醌亞胺。但由于2，4-二氯酚的二聚體不穩定，加入試劑？后，在4-氨基安替比林存在的情況下，2，4-二氯酚的二聚體及苯氧自由基也轉化為紅色醌亞胺，所測的醌亞胺實際為游離甘油和甘油三酯產生的醌亞胺之和。現有兩步酶法不能消除血清中的游離甘油的干擾，使檢測值偏高，給臨床診斷帶來誤導。
技術實現思路
為了解決現有技術中血清中TG的測定方法存在內源性甘油干擾的問題，本專利技術提供一種經濟方便易行，準確性更高、能夠消除內源性甘油影響的血清甘油三酯的兩步酶測定方法。 解決該技術問題采用的技術方案是雙色原物質同在試劑I中，試劑II僅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為血清先與試劑？于37℃溫浴3～5分鐘，血清中游離甘油與試劑I反應生成醌亞胺，加入試劑II于37℃溫浴4～7分鐘，甘油三酯水解后經一系列反應生成紅色的醌亞胺。儀器在500nm波長處檢測，以試劑？反應的醌亞胺為空白，由試劑？反應產生的醌亞胺計算出甘油三酯的含量。 上述試劑I每升Tris-HCl緩沖液內含Tris 0.10mmol～0.20mmol、2，4-二氯酚2.0mmol～4.0mmol、MgSO4 9mmol～15mmol、膽酸鈉3.0mmol～5.5mmol、Triton X-1000.08g～0.15g、ATP 0.8mmol～2.0mmol、GK 400U～800U、GPO 3000U～4200U、POD 800U～1600U、4-氨基安替比林0.8mmol～2.4mmol、Proclin300防腐劑100μl～300μl；試劑II每升Tris-HCl緩沖液內含Tris 0.10mmol～0.20mmol、LPL 16000U～32000U、Proclin300防腐劑100μl～300μl。 上述試劑I中雙色原物質一個為4-氨基安替比林，另一個選自2，4-二氯酚或苯酚的衍生物。 上述試劑I和試劑II中Tris-HCl緩沖液的pH值為7.6±0.2。 上述測定中反應物的體積比為樣品∶試劑I∶試劑II＝1∶75～80∶25～20。 本方法的試劑雖與原有的兩步酶法試劑成分相同，只是將4-氨基安替比林改為與2，4-二氯酚同在試劑I，但其加入試劑I后的反應產物與原有加入試劑I后反應產物不同，測定效果明顯不同。 本專利技術試劑I中含有GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚雙色原物質等組分，試劑II僅含有脂蛋白脂肪酶有效組分。血清先與試劑I溫浴，由于試劑I中包含有GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚等雙色原物質，因此在試劑I的反應中游離甘油生成醌亞胺，加入試劑本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種血清中甘油三酯的兩步酶測定方法，其特征在于雙色原物質同在試劑Ⅰ中，試劑Ⅱ僅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為：血清先與試劑于３７℃溫浴３～５分鐘，血清中游離甘油與試劑的反應生成醌亞胺，加入試劑后于３７℃溫浴４～７分鐘，甘油三酯水解后經反應也生成醌亞胺；儀器在５００－５２０ｎｍ波長處檢測，以試劑反應產生的醌亞胺為空白，由試劑反應產生的醌亞胺計算出甘油三酯的含量，計算公式為：　　ＯＤＴＧ＝ＯＤ２－ＯＤ１×［（ＳＶ＋Ｒ１Ｖ１）／（ＳＶ＋Ｒ１Ｖ１＋Ｒ２Ｖ２）］　　甘油三酯濃度＝Ｆ×ＯＤＴＧ　　其中ＯＤＴＧ是甘油三酯產生的吸光度，ＯＤ１是樣品加入試劑反應后測得的吸光度，ＯＤ２是樣品加入試劑反應后測得的吸光度，ＳＶ是血清樣品的體積，Ｒ１Ｖ１是試劑Ⅰ的體積，Ｒ２Ｖ２是試劑Ⅱ的體積，Ｆ是校正因數。

【技術特征摘要】
1.一種血清中甘油三酯的兩步酶測定方法，其特征在于雙色原物質同在試劑I中，試劑II僅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為血清先與試劑？于37℃溫浴3～5分鐘，血清中游離甘油與試劑？的反應生成醌亞胺，加入試劑？后于37℃溫浴4～7分鐘，甘油三酯水解后經反應也生成醌亞胺；儀器在500-520nm波長處檢測，以試劑？反應產生的醌亞胺為空白，由試劑？反應產生的醌亞胺計算出甘油三酯的含量，計算公式為ODTG＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]甘油三酯濃度＝F×ODTG其中ODTG是甘油三酯產生的吸光度，OD1是樣品加入試劑？反應后測得的吸光度，OD2是樣品加入試劑？反應后測得的吸光度，SV是血清樣品的體積，R1V1是試劑I的體積，R2V2是試劑II的體積，F是校正因數。2.根據權利要求1所述的血清中甘油三酯的兩步酶測定方法，其特征在于試劑I中雙色原物質一個為4-氨基安替比林，另一個選自2，4-二氯酚或苯酚的衍生物。3.根據權利要求1所述的血清中甘油三酯的兩步酶測定方法，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李立和，
申請(專利權)人：李立和，
類型：發明
國別省市：12[中國|天津]