一種篩選唾液酸生物合成抑制劑的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種篩選唾液酸生物合成抑制劑的方法，該方法主要包括步驟：構(gòu)建誘導型GFP?GAT1融合蛋白表達載體；GFP?GAT1融合蛋白在Hek293細胞中表達；檢測加入化合物后GFP?GAT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系Hek293吸收GABA量值；如對吸收值有抑制作用，可再進一步通過凝集素斑點印跡法檢測唾液酸含量。本發(fā)明專利技術(shù)的方法主要利用GAT1蛋白活性與其糖鏈末端唾液酸結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)的原理，可用于唾液酸生物合成抑制劑的開發(fā)應(yīng)用過程中進行篩選，如對GAT1蛋白活性無影響即可排除其作為抑制劑的可能，方便準確，用量少，可降低成本。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種篩選唾液酸生物合成抑制劑的方法。
技術(shù)介紹
唾液酸(Sialic acid)，又稱N-乙酰基神經(jīng)氮酸，是一系列9-碳原子單糖的衍生物。唾液酸是哺乳類動物體內(nèi)糖復合物的基本組分(Corfield，1982)。在人體組織中，只有3種不同類型的唾液酸，所述的Neu5Ac，9-O-乙酰化的Neu5Ac和9-O-乳糖化的Neu5Ac。唾液酸家族對糖復合物的結(jié)構(gòu)多樣性起了重要作用。因此，許多生物學功能與唾液酸有關(guān)。由于它們的物理性質(zhì)，如負電荷和空間分布，唾液酸直接影響糖復合物的其直接環(huán)境，因此它們的功能可以劃分成兩人類并解釋許多現(xiàn)象。唾液酸作為生物掩體來屏蔽識別位點(Kelm and Schauer 1997；Schauer 2009)。另一方面，唾液酸的結(jié)構(gòu)多樣性使得它們能夠通過與種類繁多的分子的特異性結(jié)合充當識別決定簇(Lasky 1995)。例如：唾液酸是病原體如病毒，細菌，寄生蟲和毒素的高度特異性的結(jié)合受體的必須成分(Schauer，1985；Varki 1992)，如流感病毒等。在許多腫瘤細胞表面上的高濃度唾液酸與惡性腫瘤的提高相關(guān)。唾液酸掩蓋了許多癌細胞以及病原體的抗原決定簇，然后逃避免疫監(jiān)視(Dennis and Laferte 1985)。只有當通過唾液酸酶處理除去唾液酸后，這些癌細胞以及病原體才可以可以被自然殺傷細胞(Ahrens and Ankel 1987)識別和裂解。因此唾液酸的生物合成抑制劑的開發(fā)也是用于癌癥治療的途徑之一，但目前尚無方便有效且成本不高的方法用以篩選唾液酸生物合成抑制劑。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于，提供一種篩選唾液酸生物合成抑制劑的方法。根據(jù)本專利技術(shù)方法，其特征包括：構(gòu)建GFP-GAT1融合蛋白表達載體；GFP-GAT1融合蛋白在Hek293細胞中表達；檢測加入化合物后GFP-GAT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系Hek293吸收GABA最值；如對吸收值有抑制作用，可再進一步通過凝集素斑點印跡法檢測唾液酸含量。本專利技術(shù)主要利用GAT1蛋白活性與其糖鏈末端唾液酸結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)的原理，獲得的方法可應(yīng)用于可在唾液酸生物合成抑制劑的開發(fā)應(yīng)用過程中進行篩選，如對GAT1蛋白活性無影響即可排除其作為抑制劑的可能，方便準確，用量少，可降低成本。附圖說明下面結(jié)合附圖對本專利技術(shù)作進一步說明：圖1：構(gòu)建GFP-GAT1融合蛋白表達載體及該融合蛋白在各類哺乳細胞中表達：通過B.FACS分析和C.熒光顯微鏡檢測該蛋白在CHO、CHOLec3和Hek293細胞中的表達圖2：GFP-GAT1融合蛋白在各類哺乳細胞中的活性測試圖3：蛋白活性與唾液酸含量關(guān)系：Western印跡法檢測A.細胞GAT1總蛋白、B.膜上GAT1蛋白、凝集素印跡法測定C.GAT1蛋白唾液酸，D、E.GAT1蛋白唾液酸和活性定量圖4：用以篩選的N-乙酰葡萄糖胺類似物圖5：各化合物對GFP-GAT1融合蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)的Hek293細胞的GAT1蛋白活性的影響測試圖6：Western印跡法和凝集素印跡法鑒定化合物對唾液酸的生物合成抑制作用具體實施方式以下結(jié)合具體實例，對本專利技術(shù)進一步說明。應(yīng)理解，以下實例今說明本專利技術(shù)而非用于限定本專利技術(shù)的范圍。構(gòu)建GFP-GAT1融合蛋白表達載體及該融合蛋白在各類哺乳細胞中表達：構(gòu)建GFP-GAT1融合蛋白有利于在蛋白表達后快速檢測，利用FACS分析和熒光顯微鏡均可快速方便地檢測到該融合蛋白在CHO、CHOLec3和Hek293細胞中的高度表達(圖1)。同時通過GABA攝取實驗可測得，這三類細胞均具有的GAT1蛋白活性(圖2)。通過定量檢測可知，GAT1蛋白活性與該蛋白糖鏈末端的唾液酸含量成正比關(guān)系。(圖3)。通過該關(guān)聯(lián)性，可用GFP-GAT1融合蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)的Hek293細胞來進行唾液酸生物合成抑制劑的初篩，例如一系列合成得到的N-乙酰葡萄糖胺類似物(圖4)，該類化合物被認為是可能的唾液酸生物合成抑制劑。經(jīng)測試，各化合物對GFP-GAT1融合蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)的Hek293細胞的GAT1蛋白活性有不同的影響。其中，細胞經(jīng)過10mM的GlcNProp，GlcNHex，GlcNCyclo，GlcNAc-acetamido和3-O-Met-GlcNAc的處理，GAT1蛋白活性分別被降至54％，63％，63％，67％和53％(圖5)。此時再通過Western印跡法和凝集素印跡法進一步鑒定化合物對唾液酸的生物合成抑制作用，可見3-O-Met-GlcNAc對唾液酸的生物合成或糖蛋白的唾液酸化有一定的抑制作用。而GlcNProp，GlcNCyclo，GlcNHex和GlcNAc-acetamido則主要對糖蛋白的糖鏈末端修飾(包括唾液酸化)都有一定的抑制影響作用。綜上所述，本專利技術(shù)主要利用GAT1蛋白活性與其糖鏈末端唾液酸結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)的原理，獲得的方法可應(yīng)用于可在唾液酸生物合成抑制劑的開發(fā)應(yīng)用過程中進行篩選，如對GAT1蛋白活性無影響即可排除其作為抑制劑的可能，方便準確，亦可區(qū)別化合物對蛋白糖基化影響的程度。參考文獻：Ahrens，P.B.and Ankel，H.(1987)The role of asparagine-linked carbohydrate in natural killer cell-mediatedcytolysis.J Biol Chem，262，7575-7579.Corfield，A.P.，Schauer，R.(1982)Occurrence of sialic acids.In：Sialic acids(Schauer，R.；Springer，Wien，NewYork)，5-50Dennis，J.W.and Laferte，S.(1985)Recognition of asparagine-linked oligosaccharides on murine tumor cells bynatural killer cells.Cancer Res，45，6034-6040.Kelm，S.and Schauer，R.(1997)Sialic acids in molecular and cellular interactions.Int Rev Cytol，l 75，l 37-240.Lasky，L.A.(1995)Selectin-carbohydrate interactions and the initiation of the inflammatory response.Annu RevBiochem，64，113-139.Schauer，R.(1985)Sialic acids and their role as biological masks.Trends Biochem.Sci.10，357-360Schauer，R.(2009)Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions.Curt Opin Struct Biol，l9，507-514.Varki，A.(1992)Diversity in the sialic acids.Glycobiology，2，25-40.本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種篩選唾液酸合成抑制劑的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：(1)構(gòu)建GFP?GAT1融合蛋白表達載體；(2)GFP?GAT1融合蛋白在Hek293細胞中表達；(3)檢測加入化合物后GFP?GAT1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系Hek293吸收GABA量值；(4)如對吸收值有抑制作用，通過凝集素斑點印跡法檢測唾液酸含量。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種篩選唾液酸合成抑制劑的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：(1)構(gòu)建GFP-GAT1融合蛋白表達載體；(2)GFP-GAT1融合蛋白在Hek293...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡靜，
申請(專利權(quán))人：江南大學，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32