【技術實現步驟摘要】
本公開涉及基因測序，尤其涉及一種文庫擴增單克隆純度表征方法。
技術介紹
1、現階段高通量測序技術發展迅速，已成為目前生命研究的常用的分析方法，它具有通量高、檢測速度快、靈活多用、成本低的特點，這種技術需要dna文庫中的單個分子在帶有微反應室(如微坑)的芯片中進行擴增放大信號，從而實現同時檢測幾十萬到幾百萬的dna分子的目的。
2、在擴增前，需要將dna文庫均勻的雜交到帶有微坑的芯片表面，而dna文庫中的dna分子進入到微坑的數量符合泊松分布，即一定濃度的dna文庫隨機雜交到芯片的微坑中，使泊松分布的λ為1時(即達到最高單克隆率)，36％的微坑中有1個dna分子，36％的微坑中沒有dna分子，28％的微坑中有2個及2個以上的dna分子。
3、在后續的擴增過程中，微坑中的多個分子會同時擴增，產生包含多種dna文庫模板的多克隆，會嚴重影響測序準確度。單克隆純度低于某一閾值時，將直接影響后續測序信號的分辨，甚至無法達到測序的目的，對測序通量影響很大，因此，亟需要開發一種方法來表征文庫擴增后的單克隆純度。
技術實現思路
1、有鑒于此，本公開實施例提供了一種文庫擴增單克隆純度表征方法，能夠對文庫擴增后的單克隆純度進行表征。
2、本公開實施例提供了一種文庫擴增單克隆純度表征方法，采用如下技術方案：
3、所述文庫擴增單克隆純度表征方法包括：
4、步驟s1、設計多種文庫，每種文庫的標簽序列均不同；
5、步驟s2、設計多種測序引物
6、步驟s3、將所述多種文庫進行混合，在芯片表面的反應點中進行擴增反應生成擴增產物，不同文庫的用量之比的最大值小于5；
7、步驟s4、對所述擴增產物進行處理，生成用于進行測序反應的單鏈核酸；
8、步驟s5、提供所述多種測序引物中的一種測序引物，與所述單鏈核酸進行雜交，提供測序反應條件完成n個循環的延伸反應，每個循環延伸的堿基個數為m，收集測序信號，n≥1，m≥1；重復此步驟直至完成所有測序引物的雜交及測序信號的收集；
9、步驟s6、對所述測序信號進行強度提取，得到所述測序信號的強度數據，根據所述強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度。
10、可選地，步驟s1中，所述文庫的數量至少為4種，步驟s2中，所述測序引物的數量至少為4種。
11、可選地，步驟s3中，將所述多種文庫按相同比例進行混合。
12、可選地，步驟s5中的測序反應為3'端開放的測序反應。
13、可選地，步驟s5中，每個循環延伸的堿基個數為m，m≥3。
14、可選地，步驟s5中，在雜交一種測序引物的過程中，完成的n個循環的延伸反應中，每個循環延伸的堿基個數均相同，n≥2。
15、可選地，步驟s6中，所述根據所述強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度，包括：
16、對所述強度數據進行過濾，根據過濾后的強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度。
17、可選地，所述對所述強度數據進行過濾，包括：
18、根據雜交一種測序引物的過程中，n個循環的強度數據，對所述強度數據進行過濾，n≥2。
19、可選地，所述根據雜交一種測序引物的過程中，n個循環的強度數據，對所述強度數據進行過濾，包括：
20、計算每個反應點內所有測序引物對應的強度數據，確定每個反應點內強度數據最大的第一測序引物，保留所述第一測序引物的n個循環的強度值相差小于10％的反應點的強度數據。
21、可選地，步驟s6中，所述根據所述強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度，包括：
22、對所述強度數據進行過濾后，計算每種測序引物雜交測序過程的n個循環的強度之和，n≥2；
23、選擇強度之和最大的測序引物對應的文庫為主種；
24、根據主種對應的測序引物的雜交測序過程的n個循環的強度之和，以及所有測序引物的雜交測序過程的n個循環的強度之和，計算得到文庫擴增后的單克隆純度。
25、本公開實施例提供了一種文庫擴增單克隆純度表征方法，該文庫擴增單克隆純度表征方法包括：步驟s1、設計多種文庫，每種文庫的標簽序列均不同；步驟s2、設計多種測序引物，測序引物與文庫一一匹配對應，測序引物的3’端序列與文庫的標簽序列對應，且各測序引物與對應文庫雜交后的延伸序列均相同；步驟s3、將多種文庫進行混合，在芯片表面的反應點中進行擴增反應生成擴增產物，不同文庫的用量之比的最大值小于5；步驟s4、對擴增產物進行處理，生成用于進行測序反應的單鏈核酸；步驟s5、提供多種測序引物中的一種測序引物，與單鏈核酸進行雜交，提供測序反應條件完成n個循環的延伸反應，每個循環延伸的堿基個數為m，收集測序信號，n≥1，m≥1；重復此步驟直至完成所有測序引物的雜交及測序信號的收集；步驟s6、對測序信號進行強度提取，得到測序信號的強度數據，根據強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度。通過以上方法能夠對文庫擴增后的單克隆純度進行表征，不僅適用范圍廣，而且檢測單克隆純度的靈敏度較高，同時有助于對芯片有效測序通量做出較為準確的預測。
26、上述說明僅是本公開技術方案的概述，為了能更清楚了解本公開的技術手段，而可依照說明書的內容予以實施，并且為讓本公開的上述和其他目的、特征和優點能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實施例，并配合附圖，詳細說明如下。
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1.一種文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S1中，所述文庫的數量至少為4種，步驟S2中，所述測序引物的數量至少為4種。
3.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S3中，將所述多種文庫按相同比例進行混合。
4.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S5中的測序反應為3'端開放的測序反應。
5.根據權利要求4所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S5中，每個循環延伸的堿基個數為M，M≥3。
6.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S5中，在雜交一種測序引物的過程中，完成的N個循環的延伸反應中，每個循環延伸的堿基個數均相同，N≥2。
7.根據權利要求6所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S6中，所述根據所述強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度，包括：
8.根據權利要求7所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，所
9.根據權利要求8所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，所述根據雜交一種測序引物的過程中，N個循環的強度數據，對所述強度數據進行過濾，包括：
10.根據權利要求1～9任一項所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟S6中，所述根據所述強度數據，確定文庫擴增后的單克隆純度，包括：
...【技術特征摘要】
1.一種文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟s1中，所述文庫的數量至少為4種，步驟s2中，所述測序引物的數量至少為4種。
3.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟s3中，將所述多種文庫按相同比例進行混合。
4.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟s5中的測序反應為3'端開放的測序反應。
5.根據權利要求4所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟s5中，每個循環延伸的堿基個數為m，m≥3。
6.根據權利要求1所述的文庫擴增單克隆純度表征方法，其特征在于，步驟s5中，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈晨，喬朔，陳子天，康力，李昂，
申請(專利權)人：賽納生物科技北京有限公司，
類型：發明
國別省市：
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