【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因治療和腫瘤免疫治療，涉及局部分泌表達pd-l1單鏈抗體的重組溶瘤腺病毒及應用。是能在腫瘤局部分泌表達pd-l1單鏈抗體的重組溶瘤腺病毒zd55-apd-l1scfv的構建、擴增、純化、體外阻斷pd-l1抗原表位的驗證、體外促進人pbmc對腫瘤細胞生長抑制作用分析和小鼠體內抑制腫瘤生長作用分析，揭示了腫瘤局部分泌表達pd-l1單鏈抗體的重組溶瘤腺病毒在腫瘤藥物開發中的應用前景。
技術介紹
1、程序性細胞死亡蛋白1(programmed?cell?death?protein?1，pd-1)，由位于第2q37.3號染色體上的pdcd1基因編碼，是具有288個氨基酸的ⅰ型跨膜蛋白，屬于cd28超家族中的一員，主要表達在活化免疫細胞，如t細胞、自然殺傷性細胞(nk細胞)和b細胞表面，主要起到調節外周耐受性和自身免疫的作用。
2、pd-l1(cd274，b7-h1)由位于第9p.24.1號染色體上的cd274基因編碼，是pd-1(cd279)的配體。pd-l1主要表達在抗原呈遞細胞(apc)、樹突狀細胞(dc)、巨噬細胞、活化的單核細胞、自然殺傷(nk)細胞、t細胞、b細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經膠質細胞和腫瘤細胞，細胞因子ifn-γ能誘導多種腫瘤細胞表達pd-l1。
3、在機體免疫應答過程中，免疫檢查點信號通路能夠負調節免疫細胞的活性，使免疫應答更準確。活化的t細胞表面會表達pd-1，當pd-1結合靶細胞表面的配體pd-l1或pd-l2時，會激活t細胞一系列抑制信號，通過包括阻止增殖、誘導凋
4、針對腫瘤細胞利用pd-1/pd-l1免疫檢查點信號通路進行免疫逃逸的現象，可以通過用抑制劑阻斷pd-1和pd-l1的相互作用，恢復效應t細胞的活性。目前已經有多種pd-1和pd-l1抗體阻斷抑制劑被批準用于臨床治療，包括pd-1阻斷抗體納武利尤單抗、帕博利珠單抗、西米普利單抗、信替利單抗、卡瑞利珠單抗、特瑞利單抗、替利珠單抗、津貝利單抗、普羅戈利單抗和多斯塔利單抗；pd-l1阻斷抗體阿特珠單抗(atezolizumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)和阿維魯單抗(avelumab)。
5、然而，盡管pd-1/pd-l1阻斷抗體在一些患者治療中展現出了抗腫瘤作用，但是依然有大部分患者無法從pd-1/pd-l1阻斷治療中獲益，患者應答率低。因為pd-1/pd-l1免疫檢查點不是抗腫瘤免疫應答中唯一的限速步驟，很多腫瘤本身缺少免疫應答，被稱為“冷腫瘤”，效應免疫細胞浸潤少，尤其是免疫原性低的三陰性乳腺癌、腎癌、宮頸癌和膠質瘤等。所以，需要尋找能提升患者對pd-1/pd-l1阻斷療法應答率的治療策略。
6、此外，臨床報告顯示全身系統性遞送pd-1/pd-l1抑制劑在患者中出現12％-37％的免疫相關的毒副作用事件，其中一些事件甚至危及患者生命安全。這主要是由于全身系統性遞送pd-1/pd-l1抑制劑會導致效應t細胞的過度活化而導致。因此如何降低因全身系統性遞送免疫檢查點抑制劑造成的毒副作用也是需要我們研究解決的問題之一。
7、溶瘤病毒療法是潛在提升患者對pd-1/pd-l1阻斷療法應答率和降低因全身性遞送抑制劑造成的毒副作用的治療策略。溶瘤病毒是一類天然存在或經過基因改造的病毒，能選擇性的在腫瘤細胞復制并裂解殺死腫瘤細胞，裂解腫瘤細胞的同時能產生腫瘤相關抗原進一步激活全身性抗腫瘤免疫。目前，常見研究的溶瘤病毒類型有腺病毒(adenovirus)、單純皰疹病毒(herpes?simplex?virus)、痘苗病毒(vaccinia?virus)、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、麻疹病毒(measles?virus)、細小病毒(parvovirus)和新城疫病毒(newcastledisease?virus)等。
8、腺病毒是一種沒有包膜的雙鏈線性dna病毒，基因組長約36kb，外面主要有纖毛、五鄰體和六鄰體蛋白組成的二十面體衣殼包裹，病毒顆粒直徑約為80-110nm。自上世紀50年代發現腺病毒以來，已陸續分離到52種不同血清型(serotype)人腺病毒，可以分為a～g七個亞群(subgroup)，其中2型和5型腺病毒研究較多，5型腺病毒應用最廣泛，包括疫苗、基因治療和腫瘤治療。兩者在血清學分類上屬于c亞群，在dna序列上有95％的同源性。病毒基因組分為編碼區和非編碼區，其中編碼區有與腺病毒遺傳物質復制修飾等過程密切相關的5個早期轉錄單位(e1～e4)，2個延遲轉錄單位(ⅸ和iva2)和一個與病毒顆粒組裝密切相關的晚期轉錄單位(l1～l5)。早期轉錄單位e1～e4參與調控晚期轉錄單位l1～l5，只有當早期轉錄單位積累到一定量時才啟動晚期轉錄單位的轉錄表達，所以可以通過對早期轉錄單位e1～e4的調控來控制病毒復制。目前，研究較多的為e1a基因，該基因是最早轉錄表達的一個蛋白，且e1a蛋白參與了病毒整個基因組復制的過程，所以可以通過修飾調控e1a基因的轉錄表達來控制病毒的復制。腺病毒a～g七個亞群除了遺傳物質有一定程度上的差異外，與細胞的結合靶點和進入細胞的途徑也存在差異。5型腺病毒感染細胞過程中首先通過與細胞膜上的柯薩奇-腺病毒受體(coxsackie?and?adenovirus?receptor，car)結合，從而粘附在靶細胞表面，再通過五鄰體基座上的多肽序列精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(arg-gly-asp，rgd)與細胞表面整合素αvβ3和αvβ5相互作用，形成質膜囊泡內吞病毒進入細胞，病毒基因組脫衣殼通過核孔進入細胞核進行轉錄和復制。
9、腺病毒的優勢：安全性高，病毒基因組不會整合到宿主基因組上，降低了基因突變和致癌的風險；基因組容量大，允許非必要基因的刪除和允許多個外源基因的插入；靶向性強，可以從多個維度修飾控制其靶向性；靜息期和分裂期的細胞都能有效感染；病毒復制能力強，容易獲得較高產量的病毒等。所以腺病毒作為理想的基因遞送載體和溶瘤病毒的候選對象受到廣泛關注。
10、綜上所述，溶瘤病毒可以激活機體的免疫，改善腫瘤免疫抑制微環境，使“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”，聯合免疫檢查點抑制劑能產生更好的療效。但考慮到全身性遞送免疫檢查點阻斷抗體的用藥劑量高、經濟成本高、毒副作用大，而單鏈抗體具有全長抗體相似的結合能力以及分子量小更有利于在致密的實體瘤內部穿梭等優點，利用溶瘤腺病毒在腫瘤局部表達pd-l1阻斷抗體是否比單獨的溶瘤病毒或溶瘤病毒聯合pd-l1全長阻斷抗體會有更強的抗腫瘤作用？針對這一問題，本專利技術構建了能在腫瘤局部分泌表達pd-l1單鏈抗體的重組溶瘤腺病zd55-apd-l1?scfv，探究重組溶瘤腺病毒zd55-apd-l1?scfv在體內外的抗腫瘤作用。
技術實現思路
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【技術保護點】
1.一種局部分泌表達PD-L1單鏈抗體的重組溶瘤腺病毒ZD55-aPD-L1?scFv，其特征在于，
2.權利要求1所述重組溶瘤腺病毒ZD55-aPD-L1?scFv在制備免疫治療PD-L1陽性的腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述應用是ZD55-aPD-L1?scFv在腫瘤局部分泌表達PD-L1單鏈阻斷抗體，通過促進淋巴細胞在腫瘤中的浸潤和阻斷PD-1:PD-L1信號通路，增強效應T淋巴細胞對腫瘤生長的抑制作用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述腫瘤為三陰性乳腺癌、黑色素瘤。
【技術特征摘要】
1.一種局部分泌表達pd-l1單鏈抗體的重組溶瘤腺病毒zd55-apd-l1?scfv，其特征在于，
2.權利要求1所述重組溶瘤腺病毒zd55-apd-l1?scfv在制備免疫治療pd-l1陽性的腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述應用是zd55-a...
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