一種提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法，所述方法是將元件1和元件2用于在真核生物細胞內(nèi)定點誘導3

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法
(一)

[0001]本專利技術屬于生物
，涉及提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法，特別涉及聯(lián)合TREX2提高配對Cas9單切口酶誘導的3
’
黏性末端的基因編輯效率的方法，該方法在提高基因編輯效率的同時，又不改變其有益的低脫靶效應，拓展了配對Cas9單切口酶基因編輯策略的應用。
(二)
技術介紹

[0002]規(guī)律成簇間隔短回文重復系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)是在古細菌中發(fā)現(xiàn)的一種防御機制，用來抵抗噬菌體感染以及外來質(zhì)粒入侵。該系統(tǒng)主要由兩部分組成：一個是負責切割DNA雙鏈的Cas9蛋白，另一個是負責將Cas9蛋白牽引到特定序列位置的單向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)。sgRNA在識別特定序列時依賴于PAM序列的識別，不同來源的Cas9識別不同的PAM，比如SpCas9的PAM為5
’?
NGG
?3’
，SaCas9的PAM為5
’?
NNGRRT
?3’
，SpCas9變體xCas9的PAM為5
’?
NG
?3’
。識別靶點后，Cas9
?
sgRNA解旋靶點DNA，產(chǎn)生靶鏈和非靶鏈兩條單鏈，靶鏈與sgRNA的間隔序列配對雜交。隨后，Cas9蛋白利用其HNH結構域和RuvC結構域，分別切割與sgRNA配對雜交的靶鏈和單鏈的非靶鏈。因為野生型Cas9的兩個結構域在距離PAM相同的位置分別切割兩條單鏈，產(chǎn)生平末端DSB。產(chǎn)生的平末端通過非同源末端連接(non
?
homologous end joining，NHEJ)修復在靶點位置造成堿基增刪來實現(xiàn)基因的敲除，而利用同源重組(homologous recombination，HR)完成精準的基因插入或堿基替換。
[0003]CRISPR/Cas9應用非常廣泛，但因為Cas9
?
sgRNA識別的準確度不夠理想而容易脫靶，有時有的Cas9
?
sgRNA甚至在細胞內(nèi)存在成百上千的脫靶位點。脫靶效應的不安全性給CRISPR/Cas9基因編輯的應用帶來極大的障礙。為了降低Cas9的脫靶效應，提升基因編輯安全性，研究人員對CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)進行優(yōu)化，比如通過降低Cas9
?
sgRNA與DNA間的非特異性結合而產(chǎn)生的更高特異性的SpCas9突變體eSpCas9和HF1
?
Cas9以及截短的sgRNA等。但通常這些改變也會帶來基因編輯效率下降的副作用。
[0004]此外，通過H840A和D10A突變，分別改變SpCas9的HNH結構域和RuvC結構域，產(chǎn)生SpCas9H840A(SpCas9
H
)和SpCas9D10A(SpCas9
D
)切口酶。SpCas9
H
和SpCas9
D
分別只切割解鏈靶點DNA的非靶單鏈和與sgRNA配對雜交的靶鏈，產(chǎn)生單鏈缺刻。DNA單鏈缺刻如果不形成DSB，在細胞內(nèi)可以進行快速、高效和無痕的單鏈修復。利用配對SpCas9
H
或配對SpCas9
D
，可以在臨近靶點相反鏈上誘導單鏈缺刻。配對的單鏈缺刻在DNA核酸酶或解旋酶的作用下如果轉換為攜帶5
’?
黏性末端的DSB，利用DSB修復可以實現(xiàn)高效的基因編輯。由于兩個Cas9切口酶同時脫靶到兩個臨近靶點產(chǎn)生DSB的概率幾乎為零，這種配對Cas9切口酶的策略脫靶效應極低。因此，利用配對Cas9單切口酶在靶點DNA相反的兩條鏈上誘導臨近的單鏈缺刻，產(chǎn)生攜帶黏性末端的DSB，不僅可以實現(xiàn)基因編輯，也能顯著降低傳統(tǒng)Cas9基因編輯技術所造成的脫靶效應。這是一種可以幫助解決脫靶問題的基因編輯技術，是一種更安全的基因編輯策略。事實上，配對Cas9單切口酶編輯策略可以在不犧牲基因編輯效率的情況下將脫靶效應顯著降低了50
?
1500倍。但是，如果配對Cas9切口酶策略產(chǎn)生攜帶3
’
黏性末端DSB，基
因編輯效率將大大降低，嚴重限制了配對Cas9切口酶基因編輯策略的應用。特別是，因為PAM序列的限制和SpCas9
H
相對低的切割效率，有時在選定的基因靶點上，只能由配對SpCas9
H
產(chǎn)生5
’
黏性末端的DSB，但因為SpCas9
H
單鏈切割效率不高，基因編輯效率難以滿足需求；相反，配對SpCas9
D
盡管可以高效切割單鏈，但只能產(chǎn)生3
’
黏性末端DSB，基因編輯效率同樣低下。因此，在這種場景下，提高配對Cas9單切口酶誘導的3
’
黏性末端DSB的基因編輯效率非常必要。
(三)
技術實現(xiàn)思路

[0005]本專利技術目的是針對配對Cas9單切口酶基因編輯技術中基于3
’
黏性末端DSB的基因編輯效率低下的問題，提供一種提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法，本專利技術采用了TREX2與配對Cas9單切口酶聯(lián)合的策略，高效穩(wěn)定提高了基于3
’
黏性末端DSB的基因編輯效率，而且配對Cas9單切口酶基因編輯技術所具備的低脫靶優(yōu)勢沒有被改變。此外，通過TREX2與Cas9單切口酶的融合，特別是通過DNA結合缺陷的TREX2突變體與Cas9單切口酶的融合，進一步提高了本專利技術應用的便利性和安全性。
[0006]本專利技術采用的技術方案是：
[0007]本專利技術提供一種提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法，所述方法是將元件1和元件2用于在真核生物細胞內(nèi)定點誘導3
’?
黏性末端的DNA雙鏈斷裂(DSB)的同時，提高基因編輯效率；所述元件1是配對Cas9單切口酶及其伴隨元件；元件2是3
’?5’
核酸外切酶TREX2；所述基因編輯包括基因敲除或基因敲進。
[0008]優(yōu)選的，所述3
’?5’
核酸外切酶TREX2以游離或者與Cas9單切口酶融合的方式，通過過表達質(zhì)粒、mRNA或純化蛋白質(zhì)遞送至目的細胞，與Cas9單切口酶聯(lián)合用于提高基因編輯效率。
[0009]優(yōu)選的，所述3
’?5’
核酸外切酶TREX2以GGGGS序列作為linker連接在Cas9單切口酶的C端進行融合。
[0010]優(yōu)選的，所述3
’?5’
核酸外切酶TREX2包括野生型TREX2、與DNA結合缺陷的TREX2突變體；所述TREX2突變體是指將野生型TREX2的163位、165位和167位精氨酸突變?yōu)楸彼幔瑯嫿]有DNA結合能力的TREX2突變體；所述野生型TREX2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TREX2突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，編碼基因的核苷酸序本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種提高配對Cas9單切口酶基因編輯效率的方法，其特征在于，所述方法是將元件1和元件2用于在真核生物細胞內(nèi)定點誘導3
’?
黏性末端的DNA雙鏈斷裂的同時，提高基因編輯效率；所述元件1是配對Cas9單切口酶及其伴隨元件；元件2是3
’?5’
核酸外切酶TREX2；所述基因編輯包括基因敲除或基因敲進。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述3
’?5’
核酸外切酶TREX2以游離或者與Cas9單切口酶融合的方式，通過過表達質(zhì)粒、mRNA或純化蛋白質(zhì)遞送至目的細胞，與配對Cas9單切口酶聯(lián)合用于提高基因編輯效率。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，3
’?5’
核酸外切酶TREX2以GGGGS序列作為linker連接在Cas9單切口酶的C端進行融合。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述3
’?5’
核酸外切酶TREX2為野生型TREX2、或野生型TREX2的163位、165位和167位精氨酸突變?yōu)楸彼岫鴺嫿ǖ腡REX2突變體。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，野生型TREX2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，TREX2突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述配對Cas9單切口酶包括SpCas9單切口酶及其伴隨元件、SpCas9單切口酶突變體及其伴隨元件；SpCas9單切口酶包括但不限于SpCas9 D10A和SpCas9H840A；SpCas9 D10A也記為SpCas9
D
，SpCas9 H840A也記為SpCas9
H
。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，如果配對SpCas9
D
單切口酶，且其靶點沒有重疊，配對sgRNA對應的PAM方向則為W/C方向；如果配對SpCas9
D
單切口酶的靶點有重疊，則配對sgRNA對應的PAM方向可為W/C，也可為C/W方向，但重疊區(qū)域須小于12bp才能產(chǎn)生攜帶3
’
黏性末端的DSB；如果配對SpCas9
H
單切口...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：謝安勇，馮依力，王悅，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發(fā)明
國別省市：