一種核苷二聚體及其制備方法和在DNA合成中的應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種核苷二聚體及其制備方法和在DNA合成中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)的核苷二聚體新結(jié)構(gòu)采用甲基磷酸酯、β

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種核苷二聚體及其制備方法和在DNA合成中的應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及DNA合成
，尤其是涉及一種核苷二聚體及其制備方法和在DNA合成中的應(yīng)用，特別涉及一種新骨架核苷二聚體制備方法及其在DNA合成中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]合成生物學(xué)是一項顛覆性的前沿技術(shù)，被認為是繼發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)及人類基因組計劃后的第三次生物技術(shù)革命。合成生物學(xué)發(fā)展的核心是基因信息的讀取、分析、設(shè)計、合成與編輯。從本質(zhì)上來說，合成生物學(xué)是在分子水平上對生命系統(tǒng)的重新設(shè)計和改造。其中，DNA合成是合成基因組的核心環(huán)節(jié)，是合成生物學(xué)的基石。
[0003]寡核苷酸合成是DNA從頭合成的起點。目前，廣泛使用的寡核苷酸合成方法是由Marvin H.Caruthers等人于1987年專利技術(shù)的基于固相亞磷酰胺“脫保護、偶聯(lián)、蓋帽和氧化的四步法”的化學(xué)合成技術(shù)。該方法以多孔玻璃或聚苯乙烯作為固相載體，通過一個由活化、連接、封閉和氧化四步化學(xué)反應(yīng)組成的循環(huán)反應(yīng)連接每一個核苷酸，由3'端向5'端延伸合成寡核苷酸，最后對合成好的寡核苷酸用氨水進行切割和脫保護基處理。由于該方法合成步驟長，在合成過程中需要使用酸脫保護，存在脫保護不完全以及脫嘌呤等副反應(yīng)，最終造成寡核苷酸合成錯誤率高、效率低、長度受限等問題，難以完全滿足合成生物學(xué)對高保真、低成本DNA合成的需求，需要發(fā)展新的DNA合成技術(shù)。
[0004]采用核苷二聚體進行模塊化DNA合成，可有效減少合成步驟，進而減少錯誤率，提高合成效率，有望進一步克服目前所采用的單一核苷單體循環(huán)寡核苷酸合成條件下耦合步驟多所致的合成效率低、錯誤率高的問題。比如，普通單體需要合成100次的序列，使用二聚體僅需要50次就可以完成，大大減少了反應(yīng)步驟及脫保護次數(shù)，降低了錯誤發(fā)生的概率。
[0005]高純度低成本的核苷二聚體是高保真模塊化DNA合成的基礎(chǔ)。為適用于現(xiàn)有固相亞磷酰胺合成方法，核苷二聚體通常以五價磷酸酯(P(V))為中間“接頭”，5'
?
端和3'
?
端分別是DMTr和亞磷酰胺(P(III))結(jié)構(gòu)，其常規(guī)合成流程一般是先通過核苷亞磷酰胺單體與5'
?
OH
?
3'
?
O端保護核苷經(jīng)過偶聯(lián)、氧化、3'
?
O端脫保護，合成核苷二聚體前體，再在3'
?
O端偶聯(lián)亞磷酰胺合成相應(yīng)的核苷二聚體，因此，選擇合適磷酸酯(P(V))及亞磷酰胺(P(III))，將影響核苷二聚體合成方法，乃至寡核苷酸的后處理方法，成為合成高純度核苷二聚體關(guān)鍵。
[0006]已報道的核苷二聚體主要有兩種磷酸酯保護基，β
?
氰乙基保護和甲基保護，如下所示：
[0007][0008]其中采用兩個β
?
氰乙基保護基的式II是早期核苷二聚體合成優(yōu)先選擇的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)易于脫保護，氨氣氨解即可脫除完全；且由于現(xiàn)有商業(yè)化單體主要使用β
?
氰乙基亞磷酰胺，原料易獲得。但是這種二聚體中氰乙基磷酸酯(P(V))存在氰乙基易脫除的問題，柱色譜分離時為保持亞磷酰胺穩(wěn)定所必需的堿性洗脫劑，會引起的高達15％的脫氰乙基化，嚴重影響了基于氰乙基酯的核苷二聚體的純度，不能滿足合成生物學(xué)對高保真DNA合成需求。
[0009]而選擇兩個甲基保護基的式III結(jié)構(gòu)時，甲基磷酸酯(P(V))在合成、后處理和純化過程中的穩(wěn)定性均優(yōu)于氰乙基磷酸酯。但是也存在諸多問題，一是甲酯不易脫保護，合成寡核苷酸鏈越長，所需脫除的甲酯越多，常用苯硫酚才能將甲酯保護脫除完全，后再使用氨水脫除其他保護基，而苯硫酚是一種帶有惡臭味的劇毒化學(xué)品，不利于基于二聚體的模塊化DNA合成的推廣使用；二是合成亞磷酰胺(P(III))時，甲酯的穩(wěn)定性不及氰乙基酯，現(xiàn)有文獻報道的工藝均為小量的克級(1g)制備，僅應(yīng)用于簡單序列、短鏈寡核苷酸(低于30nt)的制備，對于長鏈寡核苷酸及高保真DNA合成未見報道。
[0010]有鑒于此，為發(fā)展高純度低成本的核苷二聚體，提高寡核苷酸合成的效率，滿足合成生物學(xué)對高保真DNA合成的需求，特提出本專利技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0011]本專利技術(shù)的目的之一在于提供一種核苷二聚體，該核苷二聚體采用甲基磷酸酯、β
?
氰乙基亞磷酰胺的混合骨架，提高寡核苷酸合成的效率，滿足合成生物學(xué)對高保真DNA合成的需求，所述核苷二聚體具有如下式I所示的結(jié)構(gòu)：
[0012][0013]其中，B1和B2各自獨立地選自取代或未取代的堿基。
[0014]本專利技術(shù)的目的之二在于提供一種所述的核苷二聚體的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：亞磷酰胺甲酯單體1和3'
?
OR
p
核苷2進行反應(yīng)，后再進行氧化反應(yīng)、脫保護基團反應(yīng)，最后再和亞磷酰胺類化合物反應(yīng)，得到式I所示的核苷二聚體。該制備方法實現(xiàn)了高純度的核苷二聚體制備，達到了現(xiàn)有商品化核苷單體的水平，可滿足高保真DNA合成需求。
[0015]本專利技術(shù)的目的之三在于一種所述核苷二聚體在DNA合成中的應(yīng)用。通過拼接合成了200nt的DNA片段，測試結(jié)果顯示其錯誤率僅為3.75errors/Kb，實現(xiàn)了高保真DNA合成。
[0016]為了實現(xiàn)本專利技術(shù)的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0017]第一方面，本專利技術(shù)提供一種核苷二聚體，所述核苷二聚體具有如下式I所示的結(jié)構(gòu)：
[0018][0019]其中，B1和B2各自獨立地選自取代或未取代的堿基。
[0020]在本專利技術(shù)中，采用甲基磷酸酯(P(V))、β
?
氰乙基亞磷酰胺(P(III))的混合骨架，這種結(jié)構(gòu)主要有以下優(yōu)勢：(1)中間磷酸使用甲酯保護，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，可以得到高純度的二聚體前體。(2)二聚體前體與氰乙基亞磷酰胺反應(yīng)時，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，副產(chǎn)物較少。(3)在寡核苷酸脫保護方面，相較于式III結(jié)構(gòu)，使用該結(jié)構(gòu)單元合成的片段，甲酯含量降低了50％，脫保護速度更快，更徹底；(4)3'
?
O端β
?
氰乙基亞磷酰胺的二聚體適用現(xiàn)有的合成體系，便于二聚體在DNA合成儀上進行寡核苷酸鏈的合成。
[0021]優(yōu)選地，所述堿基選自天然堿基、經(jīng)過修飾的堿基、天然堿基的保護形式或經(jīng)過修飾的堿基的保護形式中的任意一種。
[0022]優(yōu)選地，所述堿基選自胞嘧啶基、鳥嘌呤基、腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、次黃嘌呤基、黃嘌呤基、脫氮腺嘌呤基、脫氮鳥嘌呤基、脫氮次黃嘌呤基或二氫尿嘧啶基中的任意一種。
[0023]優(yōu)選地，所述堿基的取代基選自鹵素、羧基、羥基、酰胺基、氨基、巰基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12直鏈或支鏈烷基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷氧基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷基羥基、未取代或R
a
取代的C1
?
C1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種核苷二聚體，其特征在于，所述核苷二聚體具有如下式I所示的結(jié)構(gòu)：其中，B1和B2各自獨立地選自取代或未取代的堿基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷二聚體，其特征在于，所述堿基選自天然堿基、經(jīng)過修飾的堿基、天然堿基的保護形式或經(jīng)過修飾的堿基的保護形式中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核苷二聚體，其特征在于，所述堿基選自胞嘧啶基、鳥嘌呤基、腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、次黃嘌呤基、黃嘌呤基、脫氮腺嘌呤基、脫氮鳥嘌呤基、脫氮次黃嘌呤基、二氫尿嘧啶基或假尿嘧啶基中的任意一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1
?
3中任一項所述的核苷二聚體，其特征在于，所述堿基的取代基選自鹵素、羧基、羥基、酰胺基、氨基、巰基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12直鏈或支鏈烷基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷氧基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷基羥基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷基羰基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷基酰胺基、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷氧基酰胺基、NR
N1
R
N2
、未取代或R
a
取代的C1
?
C12烷基羧基、未取代或R
a
取代的C3
?
C20環(huán)烷基、未取代或R
a
取代的C2
?
C20雜環(huán)烷基、未取代或R
a
取代的C6
?
C20芳基、未取代或R
a
取代的C2
?
C20雜芳基中的任意一種；其中，R
N1
、R
N2
各自獨立地選自氫、氘、C1
?
C12直鏈或支鏈烷基中的任意一種；R
a
選自鹵素、羧基、羥基、酰胺基、C1
?
C12直鏈或支鏈烷基、C1
?
C12烷氧基或C1
?
C12鹵代烷基中的任意一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1
?
4中任一項所述的核苷二聚體，其特征在于，所述B1和B2各自獨立地選自如下基團，其中
“”
代表基團連接位置：代表基團連接位置：其中，R'、R”、R”'各自獨立地選自氫、氘、鹵素、氨基、C1
?
C6直鏈或支鏈烷基、C1
?
C6直鏈或支鏈烷基酰基、C6
?
C12芳基、C6
?
C12芳基?；械娜我庖环N；優(yōu)選地，所述R'、R”、R”'各自獨立地選自氫、氨基、C1
?
C3直鏈或支鏈烷基、C1
?
C3直鏈或支鏈烷基酰基、苯基、苯基?；械娜我庖环N；優(yōu)選地，所述B1和B2各自獨立地選自如下基團，其中代表基團連接位置：
6.根據(jù)權(quán)利要求1
?
5中任一項所述的核苷二聚體，其特征在于，所述核苷二聚體選自如下化合物中的任意一種：下化合物中的任意一種：7.一種根據(jù)權(quán)利要求1
?
6中任一項所述的核苷二聚體的制備方法，其特征在于，所述制備方法的合成路徑如下所示：
其中，B1和B2各自獨立地選自取代或未取代的堿基，R
p
為羥基保護基團。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：(1)亞磷酰胺甲酯單體1和3'
?
OR
...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王升啟，何小羊，石安喆，鄧新秀，劉麗艷，王飛，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：